王亚丽，秦俊哲，黄亚亚, 刘凯利

1(陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安，710021) 2(咸阳泾渭茯茶有限公司,陕西 咸阳,712000)

茯砖茶是黑茶中加工工艺最复杂的一类，经汽蒸、渥堆、压制和发花等工序制成[1-4]。冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)作为茯砖茶发酵过程中的优势菌，其发花情况与茯砖茶的品质有重要关系[5]。陕西作为茯砖茶的发源地，其产品质量受到人们的高度关注，但目前有关“发花”对陕西茯砖茶品质形成作用的研究鲜有报道。本文通过对陕西茯砖茶“发花”过程中冠突散囊菌及主要功效成分的追踪检测，探究该菌对茯砖茶品质的影响，旨在为茯砖茶标准化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑毛茶(由陕西泾渭茯茶有限公司提供)、咖啡碱(CAF)、L-茶氨酸、表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)为标品，试剂为色谱纯或分析纯。

1.2 仪器与设备

P1201型高效液相色谱仪，大连依利特分析仪器有限公司；SP-756PC紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；BSH-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；XSL-2落射荧光显微镜，上海光谱仪器有限公司；LS-C50L立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备厂；LRH-400-GS智能型人工气候箱，广东省医疗器械厂；FA1004分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验设计与方法

在茯砖茶生产第2次汽蒸后分别接种两种不同的发酵剂，编号为1和2，其余为对照组(ck)。从“发花”第4天起，每隔2 d取样检测,每组各做3个重复。

发酵剂设备：刮取PDA平板上培养5 d的冠突散囊菌菌落制成一定浓度的菌悬液，将此菌悬液接种于麸皮培养基上，在28 ℃条件下培养8 d,45 ℃烘干、粉碎，即获得纯菌种冠突散囊菌发酵剂。

1.3.2 检测方法

茶多酚总量检测采用GB/T 8313—2008(酒石酸亚铁比色法)；茶多糖测定采用蒽酮-硫酸法[6]；游离氨基酸总量测定采用GB/T 8314—2013；咖啡碱测定采用GB/T 8312—2013；EGCG采用HPLC法。

冠突散囊菌数量检测采用稀释平板法。

2 结果与分析

2.1 感官审评结果分析

由表1的感官审评结果可知：2组茶样外形、滋味、汤色、叶底评价均为最佳，其主要原因是冠突散囊菌在生长繁殖过程中利用茶叶中的营养物质进行发酵，致使茶叶中的功效成分发生变化；1组茶样香气最浓，主要是因为冠突散囊菌生长茂盛所致；与1、2组茶样相比，ck组茶样香气偏淡，滋味略苦，汤色橙黄，这可能是由于冠突散囊菌利用茶叶基质的能力不佳，物质转化能力减弱，导致茯砖茶品质不佳。

表1 感官审评结果Table 1 Results of Sensory evaluation

注：外形：+++金花茂盛、金黄、砖面色泽黒褐，显梗，++金花多、显白、砖面黒褐，+金花少、砖面色泽黒褐；香气：+++浓郁菌香气，++菌花香偏淡，+有点青草味；滋味：+++滑爽醇和回甘无苦涩，++醇和无苦涩，+苦涩回甘差； 汤色：+++深红明亮，，++橙红明亮，+橙黄；叶底 +++深褐，++黄褐，+浅黄褐。

2.2 发花过程中冠突散囊菌的变化

冠突散囊菌的数量和质量一般作为判断茯砖茶质量好坏的直接标准[5]。由图1可知：ck组冠突散囊菌数量最少，为1.6×106CFU/g，1、2组茶样中金花菌数量均达到107CFU/g。

图1 不同发花天数冠突散囊菌的变化
Fig.1 The change of E.cristatum in different flooding days

图2 水浸出物含量变化
Fig.2 The change of water extract content

2.3 发花过程中功效成分的变化

2.3.1 水浸出物含量变化分析

茯砖茶的滋味通常是指茶叶中的水溶性物质(茶多酚、可溶性糖、氨基酸、咖啡碱等)组成的多味综合体[10]。水浸出物是茶叶中所有水溶性物质的总称。由图2可以看出，在发花初期(6 d以前)，水浸出物含量明显上升，这主要是因为冠突散囊菌分泌的胞外酶将茶叶中的粗纤维水解为小分子水溶性物质；发花第6天开始，茯砖茶中的水浸出物含量开始下降，这可能是由于随着茶叶中水分含量的减少冠突散囊菌由营养生长转为生殖生长，吸收利用茯砖茶中的水溶性物质。另外黄建琴[11]曾指出，茯砖茶中蛋白质等的水解产物能产生褐变，茶多酚及氧化产物与蛋白质结合均能生成水不溶性物质，使得水浸出物含量下降。整体分析得到：1组、2组以及ck组茯砖茶水浸出物含量在发花过程中分别上升1.49%、3.22%、2.88%；其中2组在发花前期水浸出物含量明显升高，这是因为2组茯砖茶中金花颗粒饱满、分布密集、代谢能力强。

2.3.2 茶色素含量变化分析

茶色素含量可以直观衡量茯砖茶品质优劣[7]。由图3可知：随着发花时间的延长，茶黄素和茶红素含量逐渐减少，茶褐素含量明显增加。产生这种现象的原因是随着茶叶内的冠突散囊菌数量逐渐增多，茶叶中原有的色素类物质(如叶绿素、类胡萝卜素、花青素等)在胞外酶及湿热条件的共同作用下分解、转化，并将多酚类物质氧化形成茶黄素、茶红素和茶褐素[8]。在发花14 d后ck组茶黄素、茶红素含量明显下降，这是因为14 d后冠突散囊菌出现明显增长，产生的多酚氧化酶增多。姚茂君[9]也曾报道冠突散囊菌在生长过程中会分泌水溶性褐色色素。感官审评结果表明：ck组汤色橙黄，这与茶色素含量低有密切的关联。

a-茶黄素含量变化；b-茶红素含量变化；c-茶褐素含量变化
图3 茶色素含量变化
Fig.3 The change of tea pigment content

2.3.3 茶多酚和EGCG含量变化分析

茶多酚是指茶叶中多元酚的混合物，其中儿茶素比重最多，而儿茶素中EGCG为主体成分。茶多酚、EGCG是茶叶中涩味的主要来源，降低该成分有利于茯砖茶醇和滋味的形成[12]。由图4可知：在发花过程中茶多酚和EGCG含量呈下降趋势，其中1组茶多酚含量下降达到5.60%，而ck组与2组相差不大，分别下降4.79%和4.66%。这种变化主要是因为冠突散囊菌在代谢过程中分泌出大量多酚氧化酶、过氧化物酶等物质将茶多酚转化为茶色素类物质，从而使得茯砖茶的汤色明亮、橙红[13]；同时，在茯砖茶加工过程中，茶多酚发生非酶促反应，含量下降。通过HPLC分析可知：EGCG含量下降最明显的为1组，达到10.46 mg/g；2组与ck组则分别下降和5.93 mg/g，其根本原因是冠突散囊菌在繁殖及水热的综合作用下，造成EGCG氧化、降解和转化，这使得茯砖茶滋味醇和、甘厚[14]。

图4 茶多酚(a)、EGCG(b)含量变化
Fig.4 The change of tea polyphenols(a) and EGCG(b) content

2.2.4 游离氨基酸含量变化分析

氨基酸是茶叶滋味与香气形成的重要前体物质，氨基酸含量的增多能改善茯砖茶的鲜爽味[12]。由图5可知：随着发花时间的增加，氨基酸含量呈现下降趋势，其中2组下降最多，达到0.20%；而1组与ck组则分别下降0.17%、0.17%。出现这种现象的原因一方面是由于在发花阶段冠突散囊菌生长繁殖过程中利用氨基酸，造成氨基酸含量的下降；另一方面是随着茯砖茶中水分、温度的变化，氨基酸与其他多酚类物质发生反应生成褐色色素，或与糖类物质发生美拉德反应，造成氨基酸含量下降，进而改善茯砖茶的汤色[16]。

图6 游离氨基酸含量变化
Fig.6 The change of free amino acid content

图8 咖啡碱含量变化
Fig.8 The change of caffeine content

2.3.5 咖啡碱含量变化分析

咖啡碱是茯砖茶中苦味的主要化学成分，咖啡碱的降低有利于减少茯砖茶的苦涩味，提升茯砖茶的口感。但由于咖啡碱具有健胃提神的功效，含量过低将会失去茯砖茶的保健功效[12]。由图5可知：发花过程中咖啡碱含量呈下降趋势，其中ck组下降最多，达到18.11 mg/g，而1、2组分别下降8.96和9.57 mg/g。其主要原因是在湿热作用下，咖啡碱与蛋白质等物质发生缔合致使其下降，减轻了茯砖茶的苦涩味；同时黄酮类物质与咖啡碱形成络合物，降低咖啡碱含量，形成茯砖茶醇和滋味[17]。从图6可看出，发花第10天后ck组咖啡碱含量骤降，可能是因为在此阶段冠突散囊菌生长旺盛，消耗大量的咖啡碱。感官审评结果中，ck组苦涩味最轻，就是因为其咖啡碱含量较低。

2.3.6 茶多糖含量变化分析

由图7可知，发花前期茶多糖含量呈上升趋势，这是由于冠突散囊菌在生长繁殖过程中分泌的胞外酶将木质纤维素分解为水溶性多糖类物质，使得茯砖茶中的茶多糖含量升高；发花后期，由于茶叶中木质纤维素被分解，冠突散囊菌利用茶叶中的多糖类物质作为碳源进行生长繁殖，使得多糖类物质含量下降，但总体而言，发花过程中茶多糖含量要比发花前多。

图7 茶多糖含量变化
Fig.7 The change of tea polysaccharide content

3 结论

研究发现“发花”过程中茯砖茶中的茶黄素、茶红素、茶多酚、游离氨基酸、咖啡碱等均出现不同程度的下降。其中茶多酚的下降主要是因为EGCG含量的下降，1组、2组以及ck组茶样中EGCG含量分别下降10.46、5.02、6.17 mg/mL，EGCG作为冠突散囊菌生长过程中的主要碳源，它的下降在很大程度上改善茯砖茶的涩味；氨基酸含量分别下降0.17%、0.20%、0.17%，氨基酸作为茶叶中管突散囊菌生长所需的氮源物质以及茯砖茶中鲜爽味的主要来源，与糖类物质发生美拉德反应，有利于改善茯砖茶的汤色；咖啡碱含量分别下降8.96、9.52、18.11 mg/mL，降低了茯砖茶的苦味，使得茯砖茶滋味更加醇和。综合感官审评结果分析，冠突散囊菌的大量繁殖以及分泌的各种胞外酶，催化茯砖茶中相关物质的转化，使得茶叶中的内含成分降解、聚合，影响茯砖茶的品质。冠突散囊菌生长旺盛，则茯砖茶品质良好，反之茯砖茶品质较差。