刘茂柯，唐玉明，熊洪，刘颖，蒋鹏，任道群，田新惠，姚万春

1(四川省农业科学院 水稻高粱研究所，四川 德阳，618000) 2(四川省泸州市酿酒科学研究所，四川 泸州，646100)

纤维素是植物光合作用的产物，细胞壁的重要成分，也是地球上最丰富的可再生性能源之一[1]。纤维素分子是以吡喃葡萄糖苷为单元，由β-1,4-糖苷键连接形成的直链多糖，通过氢键缔合形成纤维束[2]。由于分子结构稳定，自然状态难被降解，导致目前大量纤维素资源未得到充分利用[3]。

利用纤维素酶将纤维素降解成可发酵性糖是利用纤维素资源的有效途径[1]。纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖和纤维二糖的一组酶系的总称[2]，由于其主要由纤维素降解菌在诱导物的作用下产生，选育高效的纤维素降解菌成为了有效利用纤维素资源的关键[1]。虽然已有研究选育的许多菌株显示出良好的应用效果[4-7]，但总体上，我国纤维素酶工业仍处于初级开发阶段，受酶催化率低、生产成本高和周期长等问题的影响，纤维素酶的制备远无法满足工业发展的需要[2]。因此，进一步发掘高活力的纤维素降解菌尤为必要。

白酒酿造环境具有丰富的微生物资源，是选育高效发酵菌株的天然宝库[8-10]。近年研究表明，纤维素降解菌是参与白酒酿造的优势菌群[11-13]。酒醅是酿酒原料经微生物发酵的产物，也是白酒发酵物质能量代谢活动最活跃的反应中心[9]。理论上，以酒醅为研究材料更有利于分离高活力的功能菌株。因此，本研究探讨白酒酒醅纤维素降解细菌的群落多样性，从中筛选高效菌株，旨在为纤维素资源的有效利用提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

酒醅样本于2017年采自泸州市某知名白酒企业。浓香和清香型酒醅样品分别采自4和3个酒醅堆。采样方法是以酒醅堆中心为采样点，取距表层40 cm处酒醅 (50 g)，于 -80 ℃ 保存。

1.2 主要试剂和仪器

化学试剂 (分析纯)、Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、PCR引物：生工生物工程 (上海)股份有限公司；EZNATM总DNA抽提试剂盒：美国Omega公司；PCR仪S1000、DGGE仪DCode Universal Mutation Detection System：美国Bio-Rad公司；PCR试剂、pGEM-T载体、EscherichiacoliJM109：宝生物工程 (大连) 有限公司；分光光度计UV2550：日本Shimadzu公司。

1.3 培养基

羧甲基纤维素钠培养基 (CMC-Na培养基)[14]、刚果红培养基[15]、酶活培养基[15]、滤纸液体培养基[14]、LB培养基和秸秆液体培养基。秸秆液体培养基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨 2.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，酵母膏2 g，蒸馏水1 000 mL，添加10 g水稻秸秆或10 g 小麦秸秆。秸秆的制备: 80 ℃烘干至恒重，并剪切成 0.5 cm×1 cm的片状。LB 培养基：酵母浸出粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20 g，pH 7.0。所有培养基121 ℃ 灭菌15 min备用。

1.4 方法

1.4.1 富集培养

将10 g酒醅样品置于90 mL CMC-Na液体培养基，28 ℃、200 r/min振荡培养72 h后取菌液2 mL接种于100 mL CMC-Na液体培养基，按上述培养条件传代。将第3次传代的富集培养物用于DGGE分析和菌株分离。

1.4.2 酒醅样品和富集培养物细菌群落结构的DGGE分析

取3 mL 1.4.1的富集培养物于5 mL离心管，8 000 r /min离心去除上清取沉淀物。采用EZNATM总DNA抽提试剂盒分别提取沉淀物和初始酒醅样品的细菌DNA。采用引物338F-GC和518R[16]扩增 16S rRNA V3区。PCR反应体系 (50 μL) 和扩增程序分别参照LIU等[10]和FERROCINO等[17]的报道设置。PCR产物的DGGE电泳条件：聚丙烯酰胺凝胶浓度8%，变性范围30%～60% (100%变性剂含7 mol/L尿素，40%去离子甲酰胺)；使用1×TAE缓冲液，100 V电泳10 min进胶，200 V、60 ℃ 条件下电泳4 h，银染法染色。将 DGGE优势条带回收并用20 μL无菌水浸泡过夜。以浸液为模板，采用引物338F和518R进行PCR扩增后按文献[18]的方法克隆，由苏州金唯智生物科技有限公司测序。测序所得序列在美国生物技术研究中心 (National Center for Biotechnology, NCBI) 网站进行BLAST比对。用 Quantity One软件对 DGGE 图谱进行数字化和标准化处理后，进行UPGMA聚类分析，计算多样性指数 (H)[19]。

1.4.3 菌株的筛选与鉴定

取1.4.1中的富集培养物1 mL用无菌水梯度稀释10-4～10-7。将稀释液涂布于CMC-Na固体培养基，28 ℃ 恒温培养72 h，挑单菌落于LB固体培养基划线纯化并保种。参照李静等[20]的方法，将纯化菌株涂布于LB固体培养基制成5 mm菌饼，接种到刚果红固体培养基，28 ℃ 培养4 d，观察接菌处是否产生透明圈，根据透明圈直径大小初步判断菌株产纤维素酶的能力，选取透明圈直径较大的菌株继续研究。利用试剂盒提取菌株DNA，采用引物8-27F和1523-1504R进行PCR扩增[21]并测序。将测序获得的序列通过 BLAST比对获取相似度较高的模式菌株序列，用 MEGA 4.0中 Neighbor-Joining 法构建系统发育树[22]。

1.4.4 羧甲基纤维素酶 (CMCase) 活力的测定

1.4.4.1 葡萄糖标准曲线

利用 3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) 比色法绘制葡萄糖标准曲线[15]。

1.4.4.2 粗酶液的制备

挑单菌落接种到50 mL酶活培养基，28 ℃、200 r/min振荡培养，于2、3、4、5、6 d分别取发酵液，6 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，取上清即为粗酶液。

1.4.4.3 酶活测定

取0.1 mL粗酶液置于1.9 mL 10 g/L的CMC-Na溶液中，50 ℃恒温水解30 min，再加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴反应10 min后冷却至室温，定容至25 mL，540 nm处比色，测定OD值，根据葡萄糖标准曲线计算酶活。酶活定义：50 ℃条件下, 1 mL酶液每分钟催化底物生成1 μg葡萄糖的酶量，称为1个酶活单位，以U/mL表示[15]。

1.4.5 滤纸条崩解实验

将CMCase活性较高的菌株制成菌悬液，接种10 mL于90 mL滤纸液体培养基， 28 ℃、120 r/min振荡培养，定期观察滤纸条被降解的情况。

1.4.6 秸秆降解率的测定

取5 mL菌悬液 (复合菌系各菌悬液按1∶1的体积比共接种5 mL) (无菌水作对照) 分别接至45 mL秸秆液体培养基，28 ℃振荡培养7 d。将培养物5 000 r/min离心10 min，弃上清，用蒸馏水反复清洗3次(每次清洗后5 000 r/min离心10 min，弃上清)，80 ℃ 烘至恒重，用差重法计算秸秆降解率。每个处理设置3个重复。

(1)

1.5 数据分析

采用SPSS 13.0进行独立样本T检验和单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 酒醅样品及其富集培养物细菌群落结构的DGGE分析

图1为酒醅样品及其富集培养物的细菌DGGE图谱。T检验结果显示，酒醅样品及其富集培养物细菌H值无显著差异 (p>0.05)，浓香型酒醅样品与其富集培养物H值分别为2.99±0.27和3.06±0.29；清香型酒醅为2.83±0.37和3.08±0.91。

图1 酒醅样品(A)和富集培养物(B)细菌群落的DGGE图谱
Fig.1 DGGE profile of bacterial community from original Zaopei samples (A) and enrichment culture (B)
注: 字母N和Q表示浓香和清香型酒醅样品；B1～B14为测序条带编号

聚类分析结果 (图2) 显示, 同一酒醅样品与其富集培养物的细菌群落结构相似性较低，相似性系数为0.41～0.64，说明富集培养使酒醅样品菌群结构发生了显著变化。对富集培养物DGGE图谱的优势条带进行测序 (B1～B14，图1B)，所获序列与NCBI 最似序列同源性为 90.9%～100%，分类于Acinetobacter、Klebsiella、Lactococcus、Paenibacillus、Bacillus(表1)。

图2 DGGE 图谱的UPGMA聚类分析
Fig.2 UPGMA dendrogram generated based on the DGGE profiles
注：标尺数值代表样品间的相似性系数，0表示完全不同，1表示完全相似经16S rRNA基因鉴定，菌株SAAS1～SAAS6与最似模式菌株的同源性97.4%～98.9%，分类于Paenibacillus、Acinetobacter、Novosphingobium、Gluconobacter(图4)。

2.2 菌株筛选与鉴定

从富集培养物共筛选到18株能在刚果红培养基形成透明圈的细菌，选择透明圈直径较大的6株细菌(命名为SAAS1～SAAS6)进行后续试验(表2和图3)。

表1 DGGE图谱条带序列的BLAST分析Table 1 BLAST results of selected bands from the DGGE profile

图3 菌株SAAS1～SAAS6在刚果红培养基上形成的透明圈
Fig.3 Transparent circle on cellulose congo red agar plates for isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6

图4 菌株SAAS1～SAAS6 的16S rRNA系统进化树
Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree of 16S rRNA for isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6
(注：本实验所得序列用粗体表示，Methanosaeta concilii NBRC 103675T(AB679168) 为外群序列。)

2.3 CMCase活力测定

以540 nm处吸光OD值为纵坐标，葡萄糖质量(mg)为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程为y=0.402x+0.004,R2=0.995。经测定，各菌株的最高CMCase活力及到达最高酶活的时间不同 (表2)。菌株SAAS1、SAAS3和SAAS5的酶活较高，分别为92.04、84.85和103.10 U/mL；SAAS2 (66.34 U/mL)和SAAS6 (59.98 U/mL) 次之，SAAS4酶活较低，仅23.77 U/mL。以上3个水平的差异显著 (p<0.05)。此外， SAAS2、SAAS3和SAAS6达最高酶活的时间为4 d，SAAS1和SAAS5为5 d，SAAS4为3 d。

2.4 菌株对滤纸条的崩解效果

对菌株SAAS1～SAAS6进行滤纸裂解能力测试。结果显示，6株菌对滤纸条均具有一定的裂解能力 (表2)。菌株SAAS3和SAAS5的降解能力最强，滤纸溃烂成糊状 (图5)；SAAS1将滤纸裂解为长度较短的片段；其余3株细菌 (SAAS2、 SAAS4、SAAS6) 对滤纸条降解作用小，仅在滤纸边缘出现毛边。因此，取 SAAS1、SAAS3和SAAS5 进行秸秆降解率测定。

2.5 秸秆降解率测定

由图6和图7可知，菌株SAAS1、SAAS3、SAAS5对水稻秸秆和小麦秸秆均具有降解作用。此3株菌对水稻秸秆降解率分别为22.77%、7.15%、6.93%；对小麦秸秆的降解率分别为6.88%、5.56%、8.55%。按随机组合方式，将以上3菌株构建4个复合菌剂并测试其秸秆降解率。结果表明，复合菌剂SAAS1+SAAS3和SAAS1+SAAS3+SAAS5对2种秸秆的降解率较单一菌株均有显著提高 (p<0.05)。其中，SAAS1+SAAS3+SAAS5组合的降解效果最佳，对水稻秸秆和小麦秸秆的降解率分别达35.32% 和28.89%。

表2 菌株SAAS1～SAAS6的纤维素降解能力评价Table 2 Estimation of the cellulose degradation activity of isolates SAAS 1, 2, 3, 4, 5 and 6

注：透明圈直径和CMC最高酶活的实测值为3份样品重复试验数据的平均值±标准差；“+”表示滤纸软化，出现毛边； “++”表示滤纸条断裂； “+++”表示滤纸成糊状。

图5 菌株SAAS1、SAAA3和SAAS5的滤纸条崩解效果(CK表示对照组)
Fig.5 Filter paper degradation by isolates SAAS 1, 3 and 5 (CK is the control for this experimental set up)

1-SAAS1; 2-SAAS3; 3-SAAS5; 4-SAAS3+SAAS5; 5-SAAS1+SAAS3; 6-SAAS1+SAAS5; 7-SAAS1+SAAS3+SAAS5
图6 不同菌株处理对水稻秸秆 (A) 和小麦秸秆 (B) 的降解率
Fig.6 Degradation rate of rice(A) and wheat(B) straw by different isolates
(实测值为3份样品重复试验数据的平均值±标准差，不同字母表示处理间存在显著差异,p<0.05)

a-CK; b-SAAS1; c-SAAS3; d-SAAS5; e-SAAS1+SAAS3; f-SAAS1+SAAS3+SAAS5
图7 不同菌株处理对水稻秸秆 (A) 和小麦秸秆 (B) 的降解效果
Fig.7 Rice(A) and wheat(B) straw degradation by different isolates

3 讨论

环境样品的微生物数量庞大且种类繁多，采用选择性培养基富集目标菌群有利于提高菌株分离效率。研究证实，利用CMC-Na作唯一碳源是富集筛选纤维素降解菌的有效手段[14-15]。以往研究利用CMC-Na培养基富集不同环境样品的纤维素降解菌[23-24]，发现富集培养物与原始样品间的菌群结构(DGGE图谱) 存在显著差异。这与本研究结果一致，表明富集培养取得了显著效果。通过富集泥炭沼泽土的纤维素降解菌，袁楠等[24]发现富集培养物的细菌H值显著下降。但本研究发现富集培养对酒醅细菌H值无显著影响，说明富集前后样品的细菌多样性水平一致。这可能是在富集培养过程中，酒醅纤维素降解菌的生长与被淘汰菌群的衰亡水平相近所造成。另一可能的解释是，因为消亡菌体的DNA可在环境中保存较长时间不被降解[25]，DGGE揭示的物种可能并非全是纤维素降解菌，从而导致物种多样性水平的测试值高于真实值。为避免此现象的发生，本研究对酒醅细菌进行3次传代，目的是在富集纤维素降解菌的同时，降低消亡菌体DNA的优势度。由于DGGE图谱仅反映环境样品的优势物种[26]，对富集培养物DGGE的优势条带测序可较真实的反映纤维素降解菌的物种多样性。除Lactococcus外，Bacillus、Paenibacillus、Klebsiella和Acinetobacter均被研究证实为高产纤维素酶的种群[12-13, 20, 27]，表明DGGE结果的准确性。另一方面，本研究分离的Novosphingobium和Gluconobacter未被DGGE检测到。这可能是DGGE条带未被全部测序造成。事实上，方法学差异常导致研究结果出现偏差[10]，对环境样品物种多样性的检测应结合不同手段方能更真实地反映群落信息。

关于白酒酿造环境纤维素降解菌的分离，以往研究从黄水分离的细菌均以Bacillus为主[12-13]。本研究所得菌株则分类于Paenibacillus、Acinetobacter、Novosphingobium、Gluconobacter。此结果揭示酿造环境蕴藏丰富的纤维素降解菌值得发掘。产酶水平方面，曾林等[12]选育的B.endophyticusCMCase活力最高，达到153.36 U/mL，具有良好的应用前景。但CMCase活力测定是以人工合成的可溶性纤维素为底物，比天然纤维素更易被细菌分解利用。因此，仅凭CMCase活力水平难以真实反映菌株对天然纤维素的利用能力[12]。如在本研究中，菌株SAAS1、SAAS3和SAAS5的CMC酶活水平相当，但SAAS1对分子结构更接近天然纤维素的滤纸[28]的降解能力较低。所以，进一步评价菌株对天然秸秆的利用能力必不可少。

本研究供试的3株细菌 (SAAS1、SAAS3和SAAS5) 在液态发酵条件下对水稻秸秆和小麦秸秆具有较好的降解效果，但同一菌株对不同秸秆的降解能力存在差异，如菌株SAAS1 对水稻秸秆降解率达22.77%，但对小麦秸秆的降解率仅为6.88%。 此外，SAAS1对滤纸的降解能力虽低于SAAS3和SAAS5，但其对水稻秸秆的降解能力显著较高 (p<0.05)。以上现象的发生可能与菌株在利用不同碳源时所表达的纤维素酶不同，导致降解效率不同有关[15]。天然纤维素的降解常依赖多种酶的协同作用，利用不同特性的菌株构建复合菌系是提高秸秆降解率的有效手段[14, 29]。本研究通过构建复合菌系混合发酵，显著提高了菌株对秸秆的降解效果 (p<0.05)，得到的复合菌系SAAS1+SAAS3+SAAS5对水稻秸秆和小麦秸秆液态发酵7 d 的降解率分别达35.32%和28.89%。长期以来，国内外复合菌系研究面临相同的难点，即在混合菌系中，微生物群落结构及相互作用易受环境因素影响，从而导致菌系功效不稳定[30]。本研究构建的复合菌系由3株细菌组成，菌种少，利于质量控制。今后我们将针对菌株的协同机理及其配伍比例进行研究，进一步加强菌系功效，提高其生产转化能力。

4 结论

我国白酒酿造环境极为特殊，蕴藏丰富的微生物资源。为充分发挥我国白酒酿造环境的资源优势，拓展纤维素酶的种质来源，本实验结合基于分子生物学研究手段的免培养技术(DGGE)和分离培养手段解析酒醅纤维素降解菌的多样性，选育出3株具有应用潜力的纤维素降解菌，为今后构建高效稳定的复合菌系及纤维素酶的工业生产提供了新的种质资源。