雷贇涛，刘 镭，许 倩，李玉红，崔 莹

（承德医学院肿瘤研究所，河北承德 067000）

绒毛膜癌（简称绒癌）是由于滋养层细胞过度侵袭和增殖导致的一种恶性肿瘤，早期就容易发生转移，若诊治不及时可能会导致广泛转移，严重影响患者预后[1-2]。二氢杨梅素(dihydromyricetin，DMY）属黄酮类化合物，具有消炎、止咳、祛痰、镇痛的作用[3]。另外，二氢杨梅素还具有抑制肿瘤细胞的多药耐药、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭迁移的作用[4-6]。但二氢杨梅素对绒癌细胞系的作用文献报道较少。本研究以绒癌JAR细胞为研究对象，观察二氢杨梅素对绒癌JAR细胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表达的影响，为探讨二氢杨梅素影响绒癌侵袭转移的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源和主要试剂 人绒癌JAR细胞株，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。二氢杨梅素，购自国家标准物质网（批号17031501）；胎牛血清、DMEM、PBS磷酸盐缓冲液、0.25%胰蛋白酶，美国GIBCOBRL公司；Trizol总RNA提取试剂，美国Invitrogen公司；2步法RT-qPCR试剂盒、染料法qPCR试剂盒、引物MMP-2、引物GAPDH、引物PI3K、引物Akt，日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：JAR细胞在37℃含5% CO2的培养箱内培养，培养基为含10%胎牛血清的DMEM完全培养基。当细胞融合度达70%～80%时，用含0.25% EDTA的胰酶消化传代。

1.2.2 实时定量qPCR法检测JAR细胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表达：取消化后细胞以2.5×105/ml的浓度种植于60mm细胞培养皿中，待细胞融合度达到40%～50%时，给予终浓度为60μg/ml的二氢杨梅素，继续培养36h；同时设立0μg/ml 二氢杨梅素为对照组。收集细胞，提取总RNA。按照试剂盒体系进行PCR反应，反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec；共45个循环。引物序列见表1。采用2-ΔΔCt相对定量法分析实验结果，ΔΔCt=实验组（Ct目的基因-Ct管家基因）-对照组（Ct目的基因-Ct管家基因），相对表达量=2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3 统计分析 应用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计量资料的以均数±标准差（± s ）的形式表示，两组间比较采用t检验，相关分析采用Pearson相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二氢杨梅素对JAR细胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA表达的影响 与对照组相比，浓度为60μg/ml的二氢杨梅素作用JAR细胞36h，MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表达水平明显降低（P＜0.05）。见表2：

表2 各组JAR细胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表达情况（± s ）

表2 各组JAR细胞MMP-2 mRNA、PI3K mRNA、Akt mRNA的表达情况（± s ）

组别 n MMP-2 mRNA PI3K mRNA Akt mRNA对照组 4 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01二氢杨梅素组 4 0.62±0.12 0.77±0.11 0.79±0.17 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 JAR细胞MMP-2 mRNA表达与PI3K mRNA、Akt mRNA表达的相关性 浓度为60μg/ml的二氢杨梅素作用36h，JAR细胞MMP-2 mRNA的表达水平与PI3K mRNA、Akt mRNA的表达水平呈正相关关系（r=0.957、0.953，P＜0.05）。见附图：

附图 JAR细胞MMP-2 mRNA表达水平与PI3KmRNA、Akt mRNA表达水平的相关性

3 讨论

绒癌是发生于葡萄胎、流产、足月产后数月至数年的恶性肿瘤，少数为原发性[7]，主要经血液播散，转移发生早且广泛，最常见的转移部位是肺(80%)[8]。研究表明，绒癌细胞主要通过MMP-2降解Ⅳ型胶原和破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质，进而促进绒癌细胞的侵袭和迁移[9-10]。全身性化疗是治疗转移性绒癌的主要方法，多数病例可获得完全缓解，但有部分患者由于对化疗药物耐药而预后不良[8]。因此，优化药物治疗绒癌，成为亟待解决的问题。

二氢杨梅素是一种二氢黄酮醇类化合物，具有调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血糖及抗糖尿病并发症等多方面的作用[3-6]。并且有研究显示，二氢杨梅素可明显抑制人乳腺癌肿瘤细胞中MMP-2基因和蛋白的表达[6]。为探讨二氢杨梅素对绒癌JAR细胞的作用及是否通过影响MMP-2基因影响绒癌的侵袭转移，本研究发现二氢杨梅素（60μg/ml）作用36h，绒癌JAR细胞MMP-2 mRNA的表达水平明显降低，说明二氢杨梅素可能通过下调绒癌JAR细胞MMP-2基因的表达影响JAR细胞的侵袭和转移。有研究发现，PI3K/Akt信号通路与肿瘤细胞的侵袭转移有着密切关系[12-13]；王亚欣等的研究也显示，PI3K/Akt信号通路与绒癌JAR细胞和JEG-3细胞的迁移侵袭能力相关，且该通路可诱导侵袭表型的发生[14]；另外，Wang等的研究发现，二羟环氧苯并芘可通过PI3K/Akt信号通路抑制人滋养层HTR-8/SVneo细胞MMP-2蛋白的表达，并提出MMP-2为PI3K/Akt的下游分子[15]。本研究亦有类似发现，浓度为60μg/ml的二氢杨梅素作用36h，JAR细胞PI3K mRNA、Akt mRNA的表达水平亦明显降低，且JAR细胞MMP-2 mRNA表达水平与PI3K mRNA、Akt mRNA表达水平呈正相关关系。本研究提示二氢杨梅素可能通过PI3K/Akt信号通路抑制绒癌MMP-2 mRNA的表达，进而抑制绒癌细胞的侵袭转移，但尚需其他研究方法进一步验证上述结果。

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