黎 博， 魏红艳， 杨 焰， 尹美娴， 胡春林， 卢远征， 孙占朋， 廖晓星△

(中山大学附属第一医院 1急诊科， 2卫生部辅助循环重点实验室， 广东 广州 510080)

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新和多能分化潜能，在治疗缺血缺氧性脑病上有很大的前景[1]。外泌体(exosomes，Exo)是一种被细胞释放出细胞外的生物囊泡，介导细胞间的信息传递。几乎所有的哺乳动物干细胞都会释放外泌体，并具有其来源母细胞的某些特征。有大量文献报道干细胞释放的外泌体能作用于受损靶细胞产生治疗作用[2]，而神经干细胞的外泌体是否能改善低氧状态下神经元的损伤尚未见相关报道。本文拟初步探讨神经干细胞分泌的外泌体是否能减少氯化钴(cobalt chloride，CoCl2)诱导的缺氧模型中神经元的凋亡，并促进神经元的存活。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级雌性SD大鼠(孕13.5 d)和SPF级SD大鼠新生鼠(0～1 d)均由中山大学中山医学院动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2011-0029。

2 主要试剂

DMEM/F12(1∶1)培养基、Neurobasal-A培养基、DMEM basic (1×) 高糖培养基、谷氨酰胺、胎牛血清、B27、表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、Accutase细胞消化液、胰蛋白酶和青、链霉素双抗购自Gibco;多聚L-赖氨酸、阿糖胞苷和CoCl2购自Sigma；免疫细胞化学染色用小鼠抗大鼠nestin和微管相关蛋白2(microtube-associated protein 2, MAP2)单克隆抗体，ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X, Alix)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSG101)兔抗大鼠Western blot抗体购自Abcam；Hoechst 33342和TUNEL凋亡试剂盒购自Roche；CCK-8试剂盒购自Dojindo;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo。

3 主要方法

3.1NSCs的提取、培养和鉴定 取孕13.5 d的SD大鼠胚胎，在冰PBS中机械分离海马组织，离心法收集细胞，并将其重悬于DMEM/F12(1∶1)培养基中，添加20 mg/L EGF、20 mg/L bFGF、1% B27、2 mmol/L谷氨酰胺、5×103U/L 青霉素和5 mg/L链霉素。……