胡争波，李文虎，何 轩 ［南方医科大学附属韶关医院（韶关市第一人民医院）骨科，广东韶关512000］

0 引言

Nurse等在1975年从裂殖酵母细胞（S．pombe）中分离出来WEE1蛋白激酶，它属于丝／苏氨酸蛋白激酶家族。由于其可以通过抑制CDC2的活性来抑制细胞进行有丝分裂［1］，从而控制细胞周期生物钟，因此得名为“WEE”家族。WEE1激酶家族在进化上高度保守，在人体内也找到了WEE1的同源基因编码产物WEE1。研究［2］表明WEE1除了在胚胎发育、神经元极化、成骨分化、胃肠道生物钟、植物分化和根表型、细胞大小等方面具有重要作用外，WEE1在维持癌细胞生存方面的也具有不可或缺的作用。目前，以WEE1为治疗靶点的抗癌研究已经成为当前研究的热点。本文就WEE1的研究进展作一综述。

1 WEE1基因及其产物

WEE1是一个进化上高度保守的酪氨酸激酶。1991年，Igarashi首次克隆出与S pombe WEE1基因相似的人类WEE1基因，并发现二者功能相似，同时他们也确定人类细胞中存在WEE1基因（图1）。人类WEE1基因位于染色体上的11p15．4，最近DNA测序结果WEE1基因长度为21 Kbp，mRNA约有3300 bp，有12个外显子。在人体中，WEE1基因编码的核蛋白共有646个氨基酸残基。在哺乳动物中，Wee蛋白激酶家族包括WEE1、WEE2和MYT1三个成员，其中WEE1在体细胞中表达，WEE2在胚细胞中表达，MYT1在体细胞和胚细胞中都表达。

2 WEE1 mRNA转录和翻译调节

染色质重组因子ATP酶CHD5是NuRD整个转录因子复合物的组成部分，在细胞中过表达CHD5导致WEE1基因表达抑制［3］。人 Kruppel样因子2是一个cys2／His2含锌指结构的转录因子，在卵巢肿瘤细胞中KLF2通过直接结合到WEE1启动子抑制WEE1转录［4］。在人类类风湿滑膜细胞中，cFOS／AP-1可以直接激活WEE1基因［5］。另外，染色体免疫共沉淀实验还发现WEE1启动子上有转录因子TP53和MyoD结合位点，但功能是促进还是抑制未见报道。

图1 WEE1基因表达和转录翻译调节因素和因子。1，25［OH］2VD3为人1，25二羟基维生素D3；TP53为抗肿瘤基因p53；MyoD 为 Myogenic Differentiation Antigen，即成肌分化抗原；染色体解螺旋酶DNA结合蛋白5；cFOS／AP-1为骨肉瘤病毒癌基因同源物／活化蛋白转录因子；KLF-2是Krppel样转录因子2；HuR，胚胎致死异常视觉基因家族中的成员，RNA结合蛋白；miRNA微小RNA。

WEE1基因转录mRNA后，很多因子包括蛋白和小分子miRNA调节其翻译过程。HuR是一种大量存在于肿瘤的RNA结合蛋白，在压力应激下从细胞核心转位到细胞质中调节mRNA。研究［6］发现HuR直接结合到WEE1 mRNA直接影响其蛋白水平，尤其是DNA损伤后。除了HuR蛋白对WEE1 mRNA调节，目前研究较多的是小分子miRNA。miRNA是一些单链小分子RNA，通过结合到靶基因mRNA上的3'末端非编码区调节mRNA翻译。用微芯片分析发现了 3 个 miRNA（128a／155／516a-3p）定位在 WEE1转录本的3'端非翻译区，表达这些miRNA导致了WEE1蛋白下调［7］。 功能促进和功能抑制试验［8］表明MiR15 家族 miRNA15／16／424／497 等在多种肿瘤细胞中调节 WEE1表达。在某些肿瘤中miR16／26a［9］、 miRNA17-92 基因丛编码的 miRNA17／18a／19a／20a／19b／92a［10］、 以 及 miR17／20a／106b［11］、 miRNA128［12］、miRNA195［13］、miRNA497［14］等也下调WEE1 mRNA。而虽有报道缺氧、维生素1，2［OH］2VD3、生物钟基因 Per1下调等均会导致WEE1在mRNA水平升高，但它们上调WEE1 mRNA的具体机制不明。

3 WEE1的蛋白水平调节

在正常酵母细胞中，WEE1的稳定性由组蛋白合成致死蛋白Hsl1和7调节，活性由CDC2和CDC25调节。在人WEE1蛋白的调节则更为复杂（图2）。

图 2 WEE1 蛋白活性与功能调节。 Akt、CrK II、14-3-3σ、Vrp、ISCp1、 CDC2、PKA、Niml、MAPK 、CK1 δ、CK2 β 、PLK1、CD34、pin1、CDC14A、 CDC25c、 β-TrCP、CyclinB、γ-H2AX、Mus81、Eme1、ChK1、Hsp90、p53 等为蛋白或基因名称；G0／G1、S、G2／M等细胞周期。

在细胞周期进展中，WEE1存在依赖于从低磷酸化激活到超磷酸化失活，再泛素化降解的反馈回路，以保证其下游因子CDC2快速激活以准备分裂。1993年，学者发现WEE1在分裂间期的107 KD的低磷酸化形式，而在有丝分裂期则是170 KD的超磷酸化形式。而超磷酸化形式催化CDC2磷酸化的活性显著减少。在M期CDC2催化WEE1的S123p位点，PLK1催化 S53p位点，后被 β-TrCP识别，使得WEE1被超磷酸化失活后降解下调［15］。而蛋白激酶CK2β亚基在核外通过WEE1上的结构域直接结合促成 PLK1-WEE1复合物形成，促进 G2／M期过渡［16］。CK2β 也可以与 WEE1在核内结合，CK2β 抑制WEE1催化H1组蛋白磷酸化，上调CDC2的活性［17］。也有研究证实CK1δ是泛素溶酶体途径降解WEE1所必需的［18-19］，β-TrCP 复合物是 WEE1泛素化的 E3 泛素化连接酶［15，17］，CDC2、PLK1 和 CK2 催化WEE1磷酸化形成降解体后才会被β-TrCP识别，其中WEE1中的S53和S123位点磷酸化是β-TrCp识别的重要位点。此外 CDC2还能够通过催化WEE1的T186磷酸化，并特异结合cis／tran羟脯氨酰异构酶 Pin1，导致 WEE1失活［20］。 CDC2也通过磷酸化激活CDC25，但CDC25会磷酸化失活WEE1，而CDC14A可结合到WEE1的N末端逆转CDC2磷酸化的WEE1，由此形成一个反馈调节［21］。WEE1是在核外降解，因此核转位对其降解非常重要［22］。有学者［23］发现与细胞内定位有关的核内信号蛋白CrkII可与WEE1结合；而Akt在S／G2期直接结合并磷酸化激活 WEE1的 Ser642位点［24］，且 14-3-3σ 参与了WEE1从细胞核转出细胞质中定位［25］。说明这些也与WEE1降解有关。

另外，Hsp90是WEE1的分子伴侣［26］，既可以结合 WEE1，又可以结合 Chk1［27］，这个过程受 p53 调节［28-29］；而 Chk1 磷酸化 WEE1 的 S549 位点［25，30］，Chk1直接靶向作用于WEE1和CDC25［31］，从而调节WEE1的功能活性。Tral1是负责ATM／ATR相关的假性激酶，也可通过有丝分裂变化应答激酶CDR1／2拮抗Chk1，进而抑制 WEE1蛋白活性［32-33］。此外，PKA催化亚基、Niml激酶、促分裂原活化蛋白激酶MAPK、病毒蛋白Vpr诱导WEE1磷酸化增加。抑制泛素结合激酶复合物CD34［34］、Rad24和14-3-3σ上调、高水平肌醇磷酸鞘磷脂酶 C1［35］等均可导致WEE1积累。其他能够上调或稳定WEE1蛋白还有缺氧、蛋白点突变、HIV 病毒蛋白 Vpr［36-37］。 这些与WEE1的细胞周期调节功能有关（图3）。

图 3 WEE1 与细胞周期调节。 CDC2、CDC20、CyclinB、FCP1、Hub、mTOR、PLK1、Rad24、Torin1、USP44、Vrp、VitD、β-TrCP、14-3-3σ等为蛋白或基因名称；G2／M等为细胞周期。

在WEE1下游，WEE1调节CDC2上Y15位点和CyclinB上的260和270位点磷酸化［38］。WEE1通过核酸内切酶Mus81／Eme1调节DNA复制与稳定性［39-40］。 此外，WEE1 还通过抑制 γH2AX 磷酸化［39］，催化组蛋白 H2B 的 Y27 磷酸化［41］，与 H3K36作用促进RRM2表达［42］，从而保护基因组稳定。这些与WEE1的生理病理功能密不可分。

4 WEE1在癌组织中的表达和靶向治疗

4．1 WEE1在癌组织中的表达 WEE1是动物胚胎生存的必需基因，细胞中缺失WEE1基因则导致周期缺陷，异倍体和细胞凋亡。基因敲除老鼠胚胎在3．5天前因细胞凋亡死亡［43］，因此 WEE1是小鼠胚胎植入前阶段必不可少的。有研究表明WEE1在非小细胞肺癌［44］和恶性黑色素瘤［13］中能够抑癌（图 4）。但与这些研究结论相反的是，又有研究表明在恶性黑色素瘤［45］、外阴鳞癌细胞［46］、骨肉瘤［47-48］、神经母细胞瘤［14］、恶性卵巢癌［49］、乳腺癌癌细胞［50］中，WEE1的表达增加与恶性程度一致。

图4 WEE1在人体细胞中的表达及其与癌细胞靶向治疗。TP53，Trail，H3K36，Chk1／2，Hsp90 等为蛋白或基因名称。

4．2 WEE1单一靶点作用及与p53的关系 在髓母细胞瘤［51］、外阴鳞癌细胞［46］和恶性卵巢癌化疗后复发的癌细胞［49］中，单一WEE1抑制剂AZD1775就可以抑制肿瘤。在没有组蛋白H3K36癌细胞中，合成致死作用对WEE1抑制非常敏感，单纯抑制WEE1导致S期阻滞，细胞凋亡增加［42］。在基底乳腺癌细胞中，抑制WEE1能够增强TRAIL介导的细胞凋亡［52］。但在正常乳腺上皮中抑制WEE1后没有出现这些反应［50］。

p53是细胞周期G1检查站的关键因子和细胞凋亡的决定因子［9］。 很多研究［27-29］表明，WEE1 可通过p53途径调节细胞生存。研究［17］表明生物钟基因Per1下调后，导致WEE1上调而p53下调，其致瘤性增强，细胞凋亡抑制。在DNA损伤药物如阿霉素作用下，p53靶定WEE1和Chk1导致细胞阻滞在G1／S期，并增加细胞凋亡［9］。在p53wt和p53mt乳腺癌细胞系中，沉默WEE1后，p53蛋白上调，凋亡细胞增加，且WEE1的抑制效果与p53水平一致［28］。另一方面，也有研究［29，45，63］表明 WEE1 的作用与 p53 无关。因此，WEE1抑制与p53状态对癌细胞生存的影响还有待进一步阐明。

4．3 WEE1的协同效应 WEE1抑制剂AZD1775和Chk1抑制剂PD00477736对鞘细胞淋巴瘤细胞具有强烈的协同效应［54］。在黑色素瘤细胞中，WEE1抑制剂AZD1775和Chk1、2抑制剂AZD7762协同用药效果更好［55］。WEE1抑制与阿糖胞苷对急性髓系白血病AML也具有协同效果［56］。WEE1抑制剂增加了HSp90抑制剂的抗癌效果［57］。同时抑制 WEE1和Hsp90时，survivin和WEE1转录下调，内源性凋亡途径激活，在翻译水平，这两种蛋白的表达和Akt活化被抑制。单一抑制两者之一则没有这种效果。AZD1775抑制WEE1后可增强非小细胞肺癌对光子放射敏感性［58］。WEE1在大多数骨肉瘤标本中检测到有表达，抑制WEE1可增强骨肉瘤放疗敏感性［47］。4．4 WEE1与DNA损伤药及其耐药 癌细胞耐药和抗放疗是因为在S期能够很好地修复DNA的损伤，WEE1起了重要作用。顺铂处理miR497表达的细胞和WEE1抑制的细胞导致凋亡增加［14］。髓母细胞瘤中，虽然单一抑制WEE1就有抗癌效果，但抑制WEE1协同CDDP会有更好的抗癌效果［51］。在卵巢肿瘤中，转录因子KLF2显著下调，抑制WEE1后增加DNA损伤药物的效果。在顺铂耐药的细胞中经常发生 WEE1 和 Chk1 过表达［8］，而 miRNA15、16、195、424、497家族通过调节WEE1和Chk1导致肿瘤细胞顺铂耐药［4，53］。 在胰腺导管腺癌中，DNA 损伤药刺激后HuR从细胞核转位到细胞质［6］。HuR快速上调WEE1蛋白水平，增加γH2AX水平和诱导CDK1磷酸化，促进G2／M过渡期停滞。多表达HuR导致肿瘤细胞耐药，沉默WEE1导致DNA药物更敏感。在胶质母细胞瘤中，WEE1抑制增强力DNA损伤药物的效果，也增强了γ射线的效果［59］。高表达叉头蛋白能够逃避抑制WEE1诱导肿瘤干细胞凋亡，异常表达T-box转录因子叉头在人肿瘤中驱动上皮间质转化以适应肿瘤转移、耐药和耐放疗等［60］。

5 存在问题与研究方向

WEE1与癌细胞生存密切相关，应用前景广泛，需进一步深入研究。目前对WEE1的研究还存在以下问题急需解决。其一，目前学者对WEE1蛋白的分子量还没有形成统一标准。多数学者倾向于接受人类内源性WEE1是含有647个氨基酸残基，在SDSPAGE电泳迁徙为94 KD的蛋白。但Igarashi等［61］在1991年基于cDNA克隆表达分析，认为WEE1是一个分子量为49 KD，含有432个氨基酸残基的蛋白。这个49 KD的WEE1蛋白在细菌、真菌、昆虫和哺乳动物细胞系中表达进行了实验研究［62］。然而根据WEE1含有647氨基酸残基计算，其分子量约为71 KD。实际上目前也有针对分子量为约为72 KD的WEE1的抗体研究。造成这种现象的原因可能与WEE1蛋白的结构、化学修饰等有关。因此，WEE1蛋白的分子量及分子结构还是需要进一步阐明。其二，以前的研究发现，很多因素如缺氧、光刺激和维生素D诱导都可以上调WEE1mRNA的表达，但WEE1基因究竟是如何被转录激活还不清楚。其三，WEE1及其家族基因MYT1都能后磷酸化周期依赖激酶2，从而调节细胞周期进展。有研究［63］表明WEE1家族基因MYT1是炎症因子NF-kB通路的抑制因子。细胞周期调节因子CylinD1被NF-κB通路和Rb1调节，WEE1 的稳定伴随着 Rb1［31］和 p53［27］的抑制，p53 状态也影响着 WEE1的功能［27］。因此 WEE1与 p53、Rb1和NF-κB之间相互影响的机制以及WEE1与其家族基因MYT1的分工也需要进一步阐明。其四，WEE1的经典作用是其通过磷酸化抑制CDC2从而抑制细胞进入M期。其次就是WEE1在S期的基因组DNA稳定性作用。但有研究［64］表明WEE1还能与其它细胞周期的关键调节因子p53、Rb1、CylinD1、PLK相互作用，因此WEE1对细胞周期的调节作用还有待进一步研究。其五，体外癌细胞实验表明H3K36、p53、DNA复制激活通路对WEE1抑制有明显影响［42］，WEE1抑制剂在不同肿瘤中的抗癌效果也不一致。而目前WEE1抑制剂作为抗癌靶点进入临床Ⅱ期实验，但WEE1抑制剂敏感性的决定因子及肿瘤基因组特性还不清楚。这些都是后续研究需要解决的问题。

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