张春霆，周国宏，卢 蓉，孔 丽

（1浙江大学金华医院，金华市中心医院泌尿外科，浙江 金华321000；2山西省眼科医院，山西 太原 030002；3浙江省金华市人民医院妇产科，浙江 金华321000；4山西医科大学解剖学教研室，山西太原030001）

0 引言

肿瘤发生发展有多种途径，例如干细胞演化、自噬消失、信号通路异常、DNA损伤修复异常［1-4］，多个基因突变及异常表达可能参与了肿瘤的发生与进展，前列腺癌与其他肿瘤一样，也可能有多种因素参与，研究［5-8］显示Claudins可能参与多种肿瘤的发生，也有报道［9-10］其家族成员与前列腺癌的关系。本研究利用SP法对Claudin-1在前列腺癌中的表达进行检测，探讨其与前列腺癌的临床特征及病理之间的关系。

1 材料与方法

1．1 一般资料 取浙江大学金华医院和山西医科大学2010～2015年病理组织库前列腺癌组织标本72 例，年龄 51～79 岁，中位年龄（68．5±5．5）岁。 前列腺癌分为Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期33例。Gleason评分＜7分的38例，Gleason评分≥7分的34例。前列腺增生组织42例，年龄52～82岁，中位年龄（69．5±6．5）岁。两组一般状况比较，差异无统计学意义。所有患者术前均未接受放化疗和内分泌治疗，所有标本10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后3 μm连续切片。

1．2 实验方法 构建8×8点阵的组织芯片2个，一个免疫组化染色，一个阴性对照。对标记的组织利用点阵仪打点取样在多聚赖氨酸载玻片上。每例前列腺癌标本和前列腺增生标本均取1个点，6 h烤片，芯片制作完成。应用SP法进行兔抗人Claudin-1蛋白单克隆抗体免疫组化染色。各步骤间均以0．1%PBS洗5 min×3次，后DAB显色（SP试剂盒和 DAB显色剂均为北京中杉生物技术公司产品），脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1．3 结果判定 Claudin-1染色主要是细胞膜出现棕红色颗粒为阳性染色，根据阳性表达细胞数决定表达阳性。阳性表达细胞数＜10%为（-），阳性表达细胞数 10%～25%为（+），阳性表达细胞数＞50%为（++），阳性表达细胞数＞75%为（+++）。阳性表达细胞数（++）以上为阳性。

1．4 统计学处理 前列腺癌染色结果数据采用SPSS20．0统计学分析，对两样本阳性率比较进行χ2检验或Fisher概率法，p＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 Claudin-1在前列腺癌中的表达位置 免疫组化染色结果Claudin-1主要表达于细胞膜上。Claudin-1在前列腺癌中表达明显高于前列腺增生；前列腺增生阳性表达率33．33%（14／42），前列腺癌 Claudin-1 阳性表达率为 63．89%（46／72）（p＜0．05，表 1）。

A：Claudin-1在前列腺增生中的表达（×400）；B：Claudin-1在前列腺癌中的表达（×400）

表1 Claudin-1在前列腺癌和前列腺增生中的表达

2．2 Claudin-1与前列腺癌Gleason评分和临床分期之间的关系 Claudin-1在34例前列腺癌≥7分的阳性表达率为 76．47%（26／34），38 例前列腺癌＜7 分的阳性表达率为 52．63%（20／38），两者之间比较差异有统计学意义（p＜0．05）。 Claudin-1在前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期阳性表达率为52．63%（20／38），Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率为 76．47%（26／34），差异有统计学意义（p＜0．05，表 1）。

3 讨论

前列腺癌发病率在我国呈现上升趋势［11］。一段时间内，由于我国对前列腺癌筛查率低，部分患者发现时已是晚期。前列腺癌与多种基因相关。我们前期发现紧密连接蛋白参与了多种肿瘤的发生发展，它的异常导致上皮屏障遭到破坏，细胞间粘附力下降［12-13］。Claudin-1基因是其家族成员之一，其翻译的蛋白是构成紧密连接的必需成分，参与维持细胞的极性和细胞间屏障功能，并且在细胞间的传输转运及信号传导中起重要作用［14-15］。

Claudins蛋白表达有组织相关性，不同组织中Claudins蛋白表达不同，即使是同一组织表达的Claudins蛋白也有较大区别，目前认为Claudins蛋白表达异常与细胞间粘附性丢失的机制及肿瘤转移有关。然而，在一些肿瘤组织中，Claudin-1表达较正常组织下降，这也意味着Claudin-1表达下降可能也在肿瘤的发生中起参与作用。本研究采用组织芯片及免疫组化技术对前列腺癌和前列腺增生中Claudin-1表达状况进行了分析，检测结果显示，Claudin-1主要表达在细胞膜上，在胞质及胞核中表达不明显。Claudin-1在前列腺癌中呈高表达；前列腺癌和前列腺增生中 Claudin-1阳性表达率分别为63．89%（46／72）和 33．33%（14／42）。 Claudin-1 表达在 Gleason评分＜7 分的阳性表达率为 52．63%（20／38），在Gleason评分≥7 分的表达率为 76．47%（26／34），差异有统计学意义（p＜0．05）。在前列腺癌临床Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率分别为52．63%（20／38）和79．41%（26／34），差异有统计学意义（p＜0．05）。 说明其表达与前列腺癌的临床分期及Gleason评分有关，可能参与前列腺癌进展，至于它在前列腺癌进展中如何作用有待进一步研究。虽然本研究也发现Claudin-1与前列腺癌临床病理和临床分期相关，但是确切的发病机制并没有明确。

国内有利用组织芯片技术及免疫组化方法检测Claudin-1和Claudin-3蛋白在食管癌组织和癌旁黏膜中的表达，探讨Claudin-1和Claudin-3蛋白在食管癌发生发展中的作用。结果发现Claudin-1和Claudin-3蛋白阳性表达主要见于食管癌细胞膜，其次表达在细胞质中，在食管鳞癌组织和癌旁组织中Claudin-1及Claudin-3的表达率分别为 76．4%和 38．3%与24．6%和79．2%，食管鳞癌的发生可能与Claudin-1的表达上调及Claudin-3的表达下调有关［16］。也有对结肠癌中Claudin-1表达状况进行了研究，结果表明，随着肿瘤的病理进展，Claudin-1表达增高，推测其作用机制是通过增高表达的使E-钙黏蛋白表达减少，引起β-catenin在细胞内聚集，致使 β-catenin／Tef信号通路上调，促进Claudin-1高表达，还可导致金属基质蛋白酶-2活性增强，促进Claudin-4高表达。两者共同作用引起紧密连接蛋白结构和功能破坏，导致组织黏附力下降或黏附分子破坏。肿瘤细胞易脱离原发灶，黏附于周围间质或正常细胞基膜、血管、淋巴管。肿瘤细胞迁涉力、侵袭力增加促进肿瘤浸润，最终导致淋巴结转移［17］。本研究不仅对Claudin-1在前列腺癌中定位进行了观察，并对Claudin-1在前列腺癌临床分期及分级特征进行了实验研究，结果显示Claudin-1异常表达可能参与了前列腺癌的发生进展。虽然实验中Claudin-1在前列腺癌中表达不具有特异性，例如在乳腺癌中，Claudin-1却是丢失的，这种情况被认为细胞的极性丢失和细胞间生长因子失衡会以自分泌或旁分泌形式刺激上皮细胞发生乳腺肿瘤［18］。在宫颈癌中，Claudin-1表达是上升的，可能由于宫颈癌与HPV直接相关，HPV刺激Claudin-1改变有关。本研究对Claudin-1在前列腺癌中的作用机制虽未阐明，但早期联合检测也可能对前列腺癌的早期诊断有参考价值，并对预后评估有重要意义。

本研究将免疫组化和组织芯片技术相结合，对前列腺癌中Claudin-1蛋白进行了实验研究。研究结果证实Claudin-1与前列腺癌的发生发展有关，但因为Claudin-1功能复杂多样，其在前列腺癌中的作用尚需更进一步研究证实。

【参考文献】

［1］涂艳阳，杨宏伟，徐小珊．NF-κB信号通路在胶质瘤细胞凋亡中作用机制的研究进展［J］．转化医学电子杂志，2016，3（8）：1-3．

［2］邓展涛，金洁雯，赵建宁，等．自噬在肿瘤治疗中的临床转化［J］．转化医学电子杂志，2017，4（3）：12-16．

［3］涂艳阳，王 震，张永生，等．肿瘤干细胞的分子机制和调控通路［J］．转化医学电子杂志，2016，3（11）：1-7．

［4］刘 力．癌基因诱发的DNA损伤反应与肿瘤生成［J］．转化医学电子杂志，2017，4（5）：1-3．

［5］ Dubé E， Dufresne J， Chan PT， et al．Assessing the role of claudins in maintaining the integrity of epididymal tight junctions using novel human epididymal cell lines［J］．Biol Reprod，2010，82（6）：1119-1128．

［6］ Suh Y，Yoon CH，Kim RK et al．Claudin-1 induces epithelial-mesenchymal transition through activation of the c-Abl-ERK signaling pathway in human liver cells［J］ ．Oncogene，2017，36（8）：1167-1168．

［7］ Choi Y， Abdelmegeed MA， Song BJ．Preventive effects of indole-3-carbinol against alcohol-induced liver injury in mice via antioxidant，anti-inflammatory，and anti-apoptotic mechanisms： Role of gut-liveradipose tissue axis［J］ ．J Nutr Biochem，2017，55：12-25．

［8］ Aslam M， Ahmad N， Srivastava R， et al．TNF-alpha induced NFκB signaling and p65（RelA） overexpression repress Cldn5 promoter in mouse brain endothelial cells［J］．Cytokine，2012，57（2）：269-275．

［9］ Ashikari D， Takayama KI， Obinata D， et al．CLDN8， an androgenregulated gene，promotes prostate cancer cell proliferation and migration［J］ ．Cancer Sci，2017，108（7）：1386-1393．

［10］ Worst TS， Von Hardenberg J， Gross JC， et al．Database-augmented mass spectrometry analysis of exosomes identifies claudin 3 as a putative prostate cancer biomarker［J］．Mol Cell Proteomics，2017，16（6）：998-1008．

［11］叶定伟．前列腺癌的流行病学和中国的发病趋势［J］．中华外科杂志，2006，44（6）：362-364．

［12］ Kim SS， Kim CH， Kim JW， et al．Airborne particulate matter increases MUC5AC expression by downregulating Claudin-1 expression in human airway cells［J］．BMB Rep，2017，50（10）：516-521．［13］ Chen WY，Wang M， Zhang JW，et al．Acrolein disrupts tight junction proteins and causes endoplasmic reticulum stress-mediated epithelial cell death leading to intestinal barrier dysfunction and permeability［J］ ．Am J Pathol，2017，187（12）：2686-2697．

［14］ Zihni C， Mills C， Matter K， et al．Tight junctions：from simple barriers to multifunctional molecular gates．［J］ ．Nat Rev Mol Cell Biol，2016，17（9）：564-580．

［15］ Tran KA， Zhang XM， Predescu D， et al．Endothelial β-catenin signaling is required for maintaining adult blood-brain barrier integrity and central nervous system homeostasis［J］．Circulation，2016，133（2）：177-186．

［16］郭 琦，唐芙爱，李 印，等．Claudin-1和Claudin-3在食管鳞癌中的表达［J］．中国肿瘤临床，2009，36（6）：340-344．

［17］田笑笑，杜 浩，郑玉峰，等．重建Smad4基因对结肠癌细胞中Claudin-1、MMP-7 mRNA 表达的影响［J］．实用医学杂志，2013，29（17）：2787-2789．

［18］ Swisshelm K，Macek R，Kubbies M．Role of claudins in tumorigenesis［J］．Adv Drug Deliv Rev，2005，57（6）：919-928．