陈新华，李风萍，陈昭宇，郭伟洪 （南方医科大学南方医院，广东广州510515）

0 引言

胃癌（gastric cancer，GC）的发病率和死亡率均位居全球前列，严重危害人类健康［1-2］，尤其在我国，GC以局部进展期胃癌（advanced gastric cancer，AGC）为主（80%～90%）［3］，肿瘤迁移和侵袭能力强、预后差的特点非常显著［4］。近年来，分子生物学技术的进步给肿瘤的诊断和治疗提供了新思路。因此，分析和探索GC的分子生物学特性，并转化为治疗的新靶点和新方法，仍然具有非常高的临床需求和很突出的时代需求。近年来，越来越多的研究［5-6］提示microRNAs（miRNA）是调节 GC发生发展的重要机制，有望成为潜在的治疗新靶点。

miRNAs是一类单链内源性的非编码微小RNA，能对细胞凋亡、增殖及分化、神经系统发育、免疫调节等众多生命过程起到重要调控作用［7-8］。近期大量研究［9-11］表明，miRNAs的突变或异常表达与人体各种肿瘤的发生发展相关，可以促进肿瘤的进展，也可以发挥抑癌作用。miR-532-5p位于人类染色体的Xp11．23上，具有3'非翻译区的互补序列，可以通过抑制转录下调多种基因产物。miR-532-5p首先被发现在皮肤黑色素瘤中具有促癌作用［12］，但相继也有研究［13-15］发现其在多种实体肿瘤，如卵巢癌、肺癌以及肝癌中表达下调，而细胞功能试验也提示其有抑制肿瘤细胞增殖的作用。Xu等［16］首次报道了 miR-532-5p对人类GC细胞的调节作用和机制，体外试验中过表达miR-532-5p可以显著增加GC细胞集落形成和迁移的潜力，减少G1期细胞的比例，阻滞细胞周期，并且促进细胞凋亡，然而，在临床胃癌组织的检测中并未得到一致的结果。该研究未对此作进一步的延伸探索，但也提示我们，miR-532-5p与胃癌的发生发展可能存在一定关系。因此，结合目前临床上胃癌的诊治亟需开发潜在新靶点的时代需求，进一步深入明确和阐述miR-532-5p在GC发生发展过程的调节作用具有较大的科学意义，甚至可能为GC未来的诊治提供更好的选择。

模板按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，所得cDNA应用 SYBR Green I法进行荧光定量 PCR反应。试验设置3个重复，以U6作为内参，按照说明书推荐的程序进行扩增反应。计算得到的miR-532-5p的相对表达量数值以中位数为截断值，将miR-532-5p的表达水平分为低表达和高表达两组，并分析其表达高低与临床病理参数的关系。

1．2．2 细胞培养和转染 胃癌MKN45细胞株常规培养使用含 10%胎牛血清的 1640培养基，置于37℃、含5%CO2培养箱中培养。当细胞处于对数生长期时接种于6孔板，接种密度控制为4×105个／孔左右，24 h后按照转染试剂说明书利用 Lipofectamine3000转染 miR-532-5p-NC，miR-532-5p-mimics和miR-532-5p-inhibitor，根据不同实验时间要求后收集细胞进行后续实验。实验分为3组，阴性对照组（negative control， NC）、过表达组（mimics）以及干扰组（inhibitor）（表 1）。

表 1 miR-532-5p NC、mimics及 inhibitor序列

1 材料和方法

1．1 主要材料 组织标本：60例新鲜冰冻癌组织和配对癌旁组织标本选取自2016～2017年在南方医科大学附属南方医院普通外科行手术治疗的胃癌患者，所有患者术后均经病理学检查确诊，在术前没有接受放化疗等抗肿瘤治疗。试验所取癌组织为距离病灶边缘1 cm以内组织，癌旁组织为距离癌灶3 cm以外的粘膜组织。所有组织标本的采集均获得患者知情同意，并且由南方医院伦理委员会批准。

试剂：MKN45胃癌细胞购自中科院上海细胞库；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自Takara；引物由上海生工公司设计合成；D1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自HyClone；Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen；Mir-532-5p干扰序列inhibitor及过表达序列mimics由江苏吉玛公司设计合成；CCK8细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天公司；Matrigel基质胶、Transwell培养板购自Corning公司。

1．2 方法

1．2．1 荧光定量 PCR检测miR-532-5p的表达 按照RNAiso（TAKARA，日本）试剂说明书提取癌组织及其配对新鲜冰冻组织总RNA；取500 ng总RNA为

1．2．3 CCK8法检测细胞的增殖能力 转染 24 h后收集细胞，按照每孔 1×103的细胞数接种 96孔板，每组每个时间点均设置5个重复，每孔培养体积为100 μL。 24 h 细胞贴壁后，取0、12、24、48 h 作为时间点分别加入 10 μL CCK-8试剂（DOJINDO，日本），置于37℃环境中孵育2 h，然后在450 nm波长处测定吸光度，并绘制细胞生长曲线。

1．2．4 Transwell法检测细胞的迁移能力 转染 48 h后收集细胞，以200 μL不含胎牛血清的 RIPM 1640培养基重悬细胞，按照每孔 5×104的细胞加入到Transwell上室，下室加入 600 μL含10%胎牛血清的RIPM 1640培养基，孵育24 h后取出上室，去掉上室的培养基，4%多聚甲醛固定细胞15 min，用0．2%结晶紫染色25 min，用棉签擦去上室细胞，用自来水洗上室3次，正置显微镜下随机选择5个视野进行细胞计数并拍照保存。

1．2．5 Transwell法检测细胞的侵袭能力 实验方法基本同迁移实验，唯一区别为所使用是经过Matrigel基质胶包被的上室，制作方法为液态的基质胶原液以不含胎牛血清的 RIPM 1640培养基稀释8倍，取50 μL加入上室中，置于37℃环境，待基质胶凝固30 min后使用。

1．2．6 划痕试验 培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记，细胞消化后种入12孔板，细胞铺满板底后，用10 μL枪头垂直于孔板沿着横线标记均匀用力制造划痕，吸去细胞培养液，用PBS轻轻冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入无血清培养基，拍照记录。将培养板放入培养箱培养，每隔4～6 h取出拍照，直至划痕基本愈合。

1．3 统计学处理 采用SPSS22．0软件进行数据分析。实验数据以±s表示，两组数据比较采用Mann-Whitney U检验。CCK-8实验和流式凋亡实验多组数据比较采用单因素方差分析，组间数据比较采用LSD-t检验。用卡方检验或 Fisher确切概率法及Spearman法进行相关性分析。检验水准为α＝0．05，采用双侧性检验。

2 结果

2．1 GC癌组织和癌旁组织中miR-532-5p表达水平的比较 荧光定量PCR试验分析表明，60例胃癌／癌旁组织中，83．3%呈低水平（图1A），且miR-532-5p的相对表达量低于癌旁组织的相对表达水平（P＝0．0135，图 1B）。

图1 miR-532-5p在GC癌组织中的表达量

2．2 miR-532-5p在GC癌组织中表达量与临床参数之间的关系 miR-532-5p表达量与肿瘤直径（r＝0．314， P＝0．024）、远处转移（r＝ 0．536， P＝ 0．035）具有显著相关性（表2）。

2．3 NC、mimics和 inhibitors组的 MKN45 细胞内miR-532-5p表达水平 MKN45细胞转染后，与NC空白对照组相比，mimics组的miR-532-5p表达显著上调（∗∗P＝0．00015），而转染 inhibitor后，miR-532-5p表达显著下调（∗P＝0．00295），这提示 miR-532-5p低表达和过表达细胞模型构建成功。

表2 miR-532-5p表达与GC患者临床病理参数的关系

图2 NC、mimics和inhibitors组的MKN45细胞内miR-532-5p表达情况（∗p ＜0．005，∗∗p ＜0．001）

2．4 NC、mimics和 inhibitors组 MKN45 细胞增殖能力的比较 CCK8增殖实验显示，相比NC空白对照组，mimics组miR-532-5p表达上调后MKN45细胞生长曲线在4天时间点显著位于NC组下方（∗∗∗p＜0．001），inhibitors组 MKN45 细胞生长曲线在 2 天（∗p＜0．05）、3 天（∗∗∗p＜0．001）、4 天（∗∗∗p＜0．001）时间点均显著位于NC组上方。这表明，说明增强miR-532-5p的表达可以抑制MKN45细胞的增殖，而敲低miR-532-5p的表达可以增强MKN45细胞的增殖。

图3 miR-532-5p NC、mimics和inhibitors转染MKN45细胞后在1、2、3、4天时间点加入CCK8，在490 nm处分析去荧光OD值（∗p ＜0．05， ∗∗∗p ＜0．001）

2．5 NC、mimics和 inhibitors组 MKN45 细胞迁移实验 迁移实验结果显示，相对于NC对照组（实验细胞穿过上室的数量为 185．0±5．8），mimics 组发生迁移的细胞数目（60．0±2．9）显著减少（∗∗∗P ＝0．0005），inhibitors 组发生迁移的细胞数目（292．0+6．9）显著增加（∗P＝0．0318）。 说明过表达 miR-532-5p可以抑制MKN45细胞的迁移能力，反过来敲低miR-532-5p表达可以增强MKN45细胞的迁移能力。

图4 NC、mimics和inhibitors组MKN45细胞迁移能力比较。（∗表示 p ＜0．05， ∗∗∗表示 p ＜0．001， 标尺为 200×）

2．6 NC、mimics和 inhibitors组 MKN45 细胞侵袭能力的比较 细胞侵袭实验结果显示：相对于NC对照组（实验细胞穿过上室的数量为 103．3±5．3），mimics组发生侵袭的细胞数目（20．7±2．2）较 NC 组显著减少（∗∗P＝0．0061），inhibitors组发生迁移的细胞数目（223．0±11．6）较 NC 组显著增加（∗∗P＝ 0．0054）。说明过表达miR-532-5p可以抑制MKN45细胞侵袭能力，干扰miR-532-5p表达可以增强MKN45细胞的侵袭能力。

图5 NC、mimics和inhibitors组MKN45细胞、侵袭能力比较。（∗表示 p ＜0．05， ∗∗∗表示 p ＜0．0001， 标尺为 200×）。

2．7 NC、mimics和inhibitors组的划痕实验结果

相对于NC对照组，mimics组MKN45细胞在24h时内的迁移比例相对降低（∗P＝0．0192），而 inhibitors组MKN45细胞在24 h时的迁移比例相对增强（∗P＝0．0105）。说明过表达miR-532-5p可以抑制MKN45细胞迁移能力，干扰 miR-532-5p表达可以增强MKN45细胞迁移能力。

图6 NC、mimics和inhibitors组MKN45细胞划痕实验（∗p ＜0．05，标尺为 200×）

3 讨论

成熟的miRNA可以通过抑制转录调节多种基因产物，在组织中具有空间和时间的表达特异性，在细胞增殖、凋亡和分化中起重要作用［7-8，17］。 近期大量研究［11，18］表明 miRNA和肿瘤的发生发展相关。 其中，miR-532-5p被研究发现在多种肿瘤中具有调节肿瘤生物特性的功能［12，14，19］。 miR-532-5p 和 GC 发生发展的关系也有相关研究。Xu等［16］的体外实验表明，过表达miR-532-5p可以增强胃癌细胞的增殖能力，其体内实验也证实，过表达miR-532-5p可以增加小鼠体内肺重量及肺移植瘤数量。然而，该研究对新鲜GC癌组织标本进行检测，并未得到相应的实验结果。该研究未对此进一步延伸探索，但也提示我们，miR-532-5p与胃癌的发生发展可能存在一定关系。鉴于miR-532-5p潜在的肿瘤增殖调节功能和胃癌对诊治新靶标的需求，我们对此进行了进一步深入探究，以明确miR-532-5p与胃癌发生发展的关系。我们利用荧光定量PCR实验检测60例GC患者癌组织及其配对癌旁组织中miR-532-5p的表达水平，发现胃癌组织中miR-532-5p的相对表达量低于癌旁组织的相对表达水平。进一步分析miR-532-5p表达与胃癌患者临床病理参数的关系，发现肿瘤体积较大者（直径≥3 cm）和发生远处转移的癌组织中的miR-532-5p表达水平显著下调。因此，我们有理由假设miR-532-5p可以抑制GC的增殖、侵袭和转移，并且进行了后续的细胞功能实验作为验证。后续细胞功能实验进一步证实，miR-532-5p参与抑制GC的增殖、迁移和侵袭。

细胞增殖、迁移、侵袭和转移能力强是恶性肿瘤的主要特征，主要表现为肿瘤细胞的无限增殖能力、细胞周期和侵袭转移的异常调控［20-21］。目前对GC病情判断的诊疗手段有限，主要是体表超声、CT检查、MRI检查、PET-CT检查、超声内镜，往往难以精确判断病情进展［22］。而目前对GC病情的分期主要基于UICC／AJCC制定的TNM分期，现有诊断技术基础上进行TMN分期难以在治疗前对病情做出精确预判［22］，不利于做出最佳治疗方案的选择，只有结合分子生物学诊断，才能做到个体化和精准化治疗［5］。结合临床观察，GC癌组织的miRNA异常表达与胃癌的恶性程度及预后存在密切的联系，在胃癌的动态监测复发、预后甚至治疗等方面具有潜在的应用前景［5］。而本研究提示miR-532-5p能够抑制GC的增殖、侵袭和转移，GC癌组织中 miR-532-5p低表达可作为肿瘤体积较大、发生远处转移的标志，因此，miR-532-5p能够作为胃癌的病情评估、治疗方式选择和判断预后的潜在依据。综上所述，本研究提示miR-532-5p可能通过抑制GC的增殖、迁移、侵袭和转移能力而发挥抑癌作用，潜在可能作为GC抗肿瘤侵袭转移的作用靶点。miR-532-5p在GC演进中的生物相关性是一个值得深入研究的方向，可以为发病率高、预后差的GC的生物学研究提供新的方法和思路。

本研究尚存在一些不足，如组织样本较少，后期可能需要进一步大样本、多中心前瞻性临床研究来验证；其次，miR-532-5p对GC的抑癌机制尚未进一步研究，需要后续进一步实验补充。

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