李顺峰， 王安建， 张雪彦， 田广瑞， 刘丽娜， 魏书信， 高帅平

(1.河南省农业科学院 农副产品加工研究中心， 河南 郑州 450002； 2.河南农业大学 食品科学技术学院， 河南 郑州 450002)

香菇是一种营养丰富、风味独特的药食同源食用菌[1]，其含有的多糖、多酚、不饱和脂肪酸和膳食纤维等功能活性成分，在提高人体免疫力、抗肿瘤、降血脂、抗氧化等方面都具有良好的保健功效[2-6]，深受消费者喜爱。而且，文献[7]指出，与其他可食蘑菇相比，香菇中的5′-核糖核苷酸含量较高，尤其是5′-鸟苷酸(5′-GMP)、5′-肌苷酸(5′-IMP)和5′-黄苷酸(5′-XMP)和5′-腺苷酸(5′-AMP)对香菇的鲜味有增效作用。鲜味是人体味觉的第五感，具有开胃、可口和令人愉悦的感觉[8]。近年来的研究表明，鲜味可以调控人体的食欲和对食物的满足感，可减少对高能量和高糖高脂食物的摄取量，从而降低肥胖，也可帮助病人或老年人改善食欲[9]。

香菇柄是香菇深加工过程中的副产物，约占香菇干质量的15%～30%。研究表明，香菇柄不仅在营养成分上与香菇菇盖基本接近，而且膳食纤维含量远高出香菇菇盖[10]。然而，由于菇柄中含有较多的纤维素类物质，致其口感粗糙，咀嚼度差，大多数被废弃处理，全国每年废弃的香菇柄有数万吨，造成了极大的资源浪费[11]。也正是由于菇柄中纤维类物质的包裹，使得菇柄中的风味成分很难释放，其鲜香味远不如香菇菇盖浓郁醇厚[12]。

与香菇开发利用的研究报道相比，对香菇柄加工利用的报道现在较少。目前，仅有关于香菇柄面包[13]、香菇柄蜜饯[14]、香菇柄松[15]、香菇柄酒精饮料[16]等菇柄加工产品的报道，而关于香菇柄中呈鲜物质提取和利用的报道较少[12, 17]。相较于香菇菇盖，香菇柄中纤维含量较高，本文采用纤维素酶酶解香菇柄提取5′-核苷酸，并分析其组成比例和含量，以期为香菇柄风味物质的利用和香菇柄调味料的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇柄，购自郑州信基调味品城；纤维素酶(食品级，10 000 U·g-1)，南宁庞博生物工程有限公司；磷酸二氢钾、高碘酸钠、乙二醇、抗坏血酸、四水合钼酸铵等均为国产分析纯；5′-鸟苷酸(5′-GMP)、5′-尿苷酸(5′-UMP)、5′-胞苷酸(5′-CMP)、5′-腺苷酸(5′-AMP)、5′-肌苷酸(5′-IMP)，购自Sigma-Aldrich公司；5′-黄苷酸(5′-XMP)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1纤维素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸单因素实验

香菇柄40 ℃烘干后，粉碎过60目筛，称取香菇柄粉2.0 g，分别考察纤维素酶不同加酶量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、液固比(mL∶g)(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、酶解温度(30、40、50、60、70 ℃)、酶解时间(0.5、1、2、3、4、5 h)、酶解pH值(3.0、3.8、4.6、5.4、6.2、7.0)对香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影响。采用过碘酸氧化法[18]测定5′-核苷酸，每组实验重复3次，取平均值。

1.2.2纤维素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸正交试验设计

在单因素实验的基础上，选取加酶量、酶解温度、酶解pH值、酶解时间4个因素，采用L9(34)正交设计对纤维素酶酶解提取5′-核苷酸工艺进行优化。正交试验设计与水平见表1。

表1 正交因素水平

1.2.3纤维素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸的组成分析

5′-核苷酸的组成测定参考Taylor等[19]和Mau等[20]方法并稍作修改。

1.2.3.1 色谱条件

HPLC为美国戴安Ultimate 3000，配有PDA-3000检测器；色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)；流动相为0.2 mol·L-1磷酸二氢钾∶水=30∶70；检测波长为254 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃；流速1.0 mL·min-1。

1.2.3.2 标品及混合标品的配制

准确称取5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-XMP各0.100 g，用超纯水溶解后配成1mg·mL-1各核苷酸标准液。取核苷酸标准液各1 mL，定容至10 mL，得6混标溶液，各单核苷酸质量浓度为100 μg·mL-1，并依次配成70、50、30、10 μg·mL-1核苷酸混合标准液，分别吸取10 μL测定，依据峰面积绘制各5′-核苷酸标准曲线。

1.2.3.3 香菇柄5′-核苷酸组成测定

纤维素酶酶解提取得到的香菇柄5′-核苷酸过0.2 μm滤膜，取10 μL上样测定，并依据保留时间确定各5′-核苷酸，然后按峰面积计算各5′-核苷酸含量。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1加酶量对5′-核苷酸得率的影响

在液固比为20∶1，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，酶解pH值为5.4的条件下，采用不同加酶量(0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)进行酶解提取，考察加酶量对香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影响。加酶量对5′-核苷酸得率的影响见图1。

图1 加酶量对5′-核苷酸得率的影响Fig.1 Effect of cellulase amount on 5′-nucleotides content

从图1可以看出，在加酶量为0.1%～0.6%时，随着加酶量的增大，5′-核苷酸得率呈逐渐增大的趋势，并在加酶量为0.6%时，5′-核苷酸得率达到较高水平(2.62 mg·g-1)，此后继续增大加酶量，5′-核苷酸得率虽有所增加，但与加酶量为0.6%时的得率相比较无显著差异(p>0.05)。这可能是由于在较低酶浓度条件下，底物能够完全与酶结合破坏细胞壁，促使内容物释放，但在较高酶浓度情况下，底物不能对酶达到饱和而使一部分酶分子无法发挥作用[12, 21]。因此，从经济方面考虑，选择加酶量为0.6%较为适宜。

2.1.2液固比对5′-核苷酸得率的影响

在加酶量为0.6%，酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，酶解pH值为5.4条件下，考察不同液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1对香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影响(见图2)。由图2可知，当液固比由10∶1增加到20∶1时，5′-核苷酸得率由2.44 mg·g-1显著升高至2.76 mg·g-1，此后继续增大液固比，5′-核苷酸得率呈缓慢升高趋势，与液固比为20∶1时相比较，5′-核苷酸得率均未达到显著水平(p>0.05)，并且当液固比增大至50∶1时，5′-核苷酸得率仅比液固比为20∶1时增加了0.16 mg·g-1，考虑后续工作和节约资源等综合因素，选择液固比20∶1较为合适。

图2 液固比对5′-核苷酸得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratios on yield of 5′-nucleotides

2.1.3酶解温度对5′-核苷酸得率的影响

在加酶量为0.6%，液固比(mL∶g)为20∶1，酶解时间为2 h，酶解pH值为5.4条件下，考察不同酶解温度(30、40、50、60、70 ℃)对香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影响。随着酶解温度的升高，5′-核苷酸得率呈先升高后下降的趋势(见图3)。在酶解温度为40 ℃时，5′-核苷酸得率最高，为3.18 mg·g-1，这一结果可能与酶的性质有关，每种酶都有一个最适作用温度，在较低温度下，随着温度上升酶活不断增强，酶解破壁作用加强，但温度超过最适温度后，随着温度的上升酶部分或全部变性而失去酶活力[12,17,21]。故选择40 ℃作为适宜的酶解温度进行后续实验。

图3 酶解温度对5′-核苷酸得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperatures on yield of 5′-nucleotides

2.1.4酶解时间对5′-核苷酸得率的影响

在加酶量为0.6%，液固比20∶1，酶解温度为40 ℃，酶解pH值为5.4条件下，考察不同酶解时间(0.5、1、2、3、4、5 h)对香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影响(见图4)。从图4可以看出，随酶解时间的延长，5′-核苷酸得率呈逐渐升高趋势，当酶解时间为4 h时，5′-核苷酸得率达到较高水平(3.66 mg·g-1)，为酶解时间在0.5 h时得率的1.77倍，此后继续延长酶解时间至5 h时，其5′-核苷酸得率仅比4 h时高了1.45%。这是由于随着酶解时间的延长，纤维素酶能充分地与底物反应，破坏细胞壁，从而使5′-核苷酸不断溶出；当细胞壁被破坏到一定程度时，继续延长酶解时间，5′-核苷酸得率升高趋缓[12,17,21]。故选取4 h作为较佳酶解时间。

图4 酶解时间对5′-核苷酸得率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of 5′-nucleotides

2.1.5酶解pH值对5′-核苷酸得率的影响

在加酶量为0.6%，液固比20∶1，酶解温度为40 ℃，酶解时间为4 h条件下，考察不同酶解pH值(3.0、3.8、4.6、5.4、6.2、7.0)对香菇柄中5′-核苷酸提取得率的影响(见图5)。由图5可知，在实验范围内，随着pH值升高，5′-核苷酸得率逐渐升高，在pH值 4.6时，5′-核苷酸得率达到最大(3.89 mg·g-1)，随着pH值继续增大，5′-核苷酸得率呈逐渐下降的趋势。这可能是由于在适宜的pH值作用范围内，酶活性较高，能充分发挥酶的专一水解作用[21]，故选择4.6作为较适宜酶解pH值。

图5 酶解pH值对5′-核苷酸得率的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH values on yield of 5′-nucleotides

2.2 正交优化试验

以5′-核苷酸得率为指标，对香菇柄5′-核苷酸的纤维素酶酶解条件进行优化，正交试验结果见表2。

表2 正交试验设计及结果

从表2中的极差R可以看出，各因素对5′-核苷酸得率影响大小依次为B>D>C>A，即影响5′-核苷酸得率的最主要因素是酶解温度，其他依次为酶解时间、酶解pH值、加酶量。由表2中的k值可以看出，在液固比20∶1条件下，纤维素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸的优化工艺组合为A3B2C3D2，即加酶量0.8%，酶解温度40 ℃，pH值为5.4，酶解时间4 h。经验证，在此优化条件下纤维素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸得率为(4.08±0.11)mg·g-1，高于单因素实验结果和正交表内组合结果。但这一结果，显著低于吴关威等[17]采用分光光度法测定纤维素酶提取的香菇柄中呈味核苷酸(I+G)的含量(32.8 mg·g-1)，这可能与采用的测定方法不同有关[18]，本文采用的过碘酸氧化法可以专一测定5′-核苷酸。

2.3 5′-核苷酸组成分析

图6 纤维素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸各组分含量Fig.6 Contents of 5′-nucleotides components from shiitake mushroom stipe extracted by cellulase

研究采用HPLC测定纤维素酶酶解提取香菇柄5′-核苷酸含量(4.57 mg·g-1)，如图6。高于分光光度法所测结果，说明5′-核苷酸含量高低受所采用测定方法的影响。因HPLC法可直接测定各5′-单核苷酸含量，是一种比较适宜的5′-核苷酸测定方法。与前人研究相比，本研究结果与Chen等[22]所测定香菇柄5′-核苷酸含量(4.23 mg·g-1)相近，高于赵静等[23]香菇菌汤中5′-核苷酸含量(1.50 mg·g-1)。本研究所得5′-核苷酸由5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP和5′-XMP组成，且所提取5′-核苷酸主要由5′-CMP、5′-AMP和5′-XMP组成，分别占5′-核苷酸的36.67%、43.69%和16.01%。而Chen等[22]仅检测到香菇柄中的4种5′-核苷酸，未检测到5′-IMP和5′-XMP。本研究所测定纤维素酶酶解香菇柄所得的5′-GMP和5′-AMP含量为2.00mg·g-1，高于Andō[24]报道的香菇柄中5′-GMP和5′-AMP的含量(0.8 mg·g-1)。呈鲜味核苷酸由5′-GMP、5′-IMP、5′-XMP和5′-AMP组成[20]，本研究所测香菇柄中含有所有的呈鲜味核苷酸，所提取的香菇柄中呈鲜味核苷酸质量比为2.86 mg·g-1，占5′-核苷酸的62.63%，高于Chen等[22]所测定香菇柄中呈鲜味核苷酸质量比1.00 mg·g-1，其占5′-核苷酸23.64%的结果，这可能与所测定到的5′-核苷酸组成有关。

3 结 论

通过单因素实验和正交试验纤维素酶酶解反应条件的优化，得出纤维素酶酶解提取香菇柄中5′-核苷酸的优选工艺条件为液固比20∶1，加酶量0.8%，酶解温度40 ℃，pH值5.4，酶解时间4 h，此时5′-核苷酸得率为4.08 mg·g-1。

经HPLC检测，纤维素酶酶解提取香菇柄5′-核苷酸由5′-GMP、5′-UMP、5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP和5′-XMP组成，5′-核苷酸含量高于采用过碘酸氧化法所测定结果，其中呈鲜味核苷酸占5′-核苷酸的62.63%。

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