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(1.扬州大学食品科学与工程学院,江苏扬州 225000; 2.江苏省淮扬菜产业化工程中心,江苏扬州 225000; 3.江苏天之香食品有限公司,江苏宿迁 223800; 4.江苏康旺食品有限公司,江苏扬州 225000)

腊豆属于细菌型豆豉的一种。又名纳豆、酱豆,即俗称的水豆豉[1],原产于江苏宿迁黄墩湖地区,因一般在腊月制作而取名腊豆。腊豆是以豆或豆类制品为原料,经过微生物(例如芽孢杆菌、酵母菌、曲霉菌、乳酸菌等)发酵后分解大豆蛋白质获得的成品。腊豆色泽酱黄或酱红色,味道咸鲜适中,口感绵软,且营养丰富。腊豆中有一类芽孢杆菌能分泌可以溶解血栓的溶栓酶[2],所以具有调节血脂、防止血栓生成的作用。腊豆自古以来就药食两用,具有出色的营养功能、调味功能和药用功能。

中国是大豆的故乡,现如今腊豆作为一类草根美食已经深深的扎根于老百姓的生活之中。腊豆的制作工艺分为传统法和工业法两种,传统法各有差异而工业法在全国比较统一[3]。我国细菌型腊豆的制作经验虽很丰富,但目前加工过程中仍有一些不能克服的困难。一是由于细菌型腊豆常由普通老百姓手做,生产过程中各个环节难掌控。二是传统发酵腊豆pH高,促进部分腐败微生物的生长,产品安全性降低,影响贮藏期。三是传统发酵腊豆的口感较差。四是对细菌型腊豆中营养探究的比较少,因常用作调料再次制作销售的领域相对较窄,加上本身所含营养成分如氨基态氮、游离氨基酸等没有充分地挖掘,抑制了广大中国消费者对腊豆的了解,抑制了市场的开拓[4]。

本实验目的在于通过复合菌发酵改良腊豆的发酵工艺,改善腊豆的营养等指标,延长贮藏期。一方面可以继续发扬光大腊豆这一中国传统美食,另一方面可以推动其市场化、标准化、机械化、规模化发展,倡导健康食品消费,改善居民营养健康状况[5]。

1　材料与方法

1.1　材料与仪器

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)筛于发酵腊豆中,扬州大学食品微生物中心保藏;黄豆扬州市苏果超市;营养肉汤培养基:牛肉浸膏10.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化钠5.0 g,蒸馏水1000 mL,pH至7.2～7.4,121 ℃灭菌15 min，固体培养基加琼脂20.0 g;YPD培养基:酵母浸膏10.0 g,蛋白胨20.0 g,葡萄糖20.0 g,蒸馏水1000 mL,pH调节至5.5,121 ℃灭菌20 min，固体培养基加琼脂20.0 g;Tris-HCl、三氯乙酸、乙酸、100%乙醇、福林酚试剂、苯、甲醇、异丙醇、氯仿等国药集团试剂有限公司;所用试剂均为分析纯。

SPX-250B-Z型生化培养箱上海博讯实业有限公司;METTLER-TOLEDO FE20K型精密pH计梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;Sorvall ST 16R型高速冷冻离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司;755S型紫外可见分光光度计上海凌光技术有限公司;HITACH2 L-8500A型氨基酸自动分析仪日本日立公司;DT-00型电子天平美国双杰兄弟(集团)有限公司;T18型IKA均质机德国ika集团。

1.2　实验方法

1.2.1腊豆的制作工艺黄豆清洗浸泡(24 h)→蒸煮(100 ℃,20 min)→室温下冷却→接菌(100 g煮熟豆子接4 mL混合菌液)→发酵(40 ℃,24 h)→成熟(即腊豆样品)。

1.2.2菌悬液的制备结合菌落计数,采用分光光度法对三株菌株进行浓度测定,取待用菌株进行3次活化(枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌于营养肉汤培养基中37 ℃培养24 h,酿酒酵母于YPD培养基中30 ℃培养24 h),4 ℃,4000 r/min离心10 min,取沉淀加入灭菌处理过的生理盐水并调整其浓度至107cfu/mL,4 ℃保存待用。

1.2.3混料设计优化混菌发酵工艺条件采用Design Expert 8.06软件对3株待用菌株进行复配,根据林榕姗[6]等的研究采用枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的比例边界范围为0.2～0.7,酿酒酵母比例边界为0.1～0.3。

表1　复合菌株混料实验设计表Table 1　Mixture design of three strains

注：以上处理组中数据表示枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌与酿酒酵母的占总接菌量的比例,CK组为不添加复合菌的处理组,表5同。

1.2.4pH的测定称取5.0 g腊豆样品,切碎研磨,加入25 mL蒸馏水,振荡20 min,使用pH计直接测定。

1.2.5质构的测定取完整颗粒腊豆置于质构仪上进行检测,采用质构参数为硬度、弹性、咀嚼性和内聚性,测定条件:采用下压式测定,测定模式和选项:采用直径50 mm的平底柱形探头P50,探头测前速度2.00 mm/s;探头测定速度 1.00 mm/s,探头测后速度10. 00 mm/s;探头进行2次测定,间隔时间:5.00 s;测定距离:20 mm;形变量为:70%;压力:5.0 g,数据采集速率为200 pps。

1.2.6氨基态氮的测定使用甲醛滴定法,参照GB/T 5009.39-2003进行滴定和计算。

表2　发酵腊豆感官评分表Table 2　Sensory score of fermented Ladou

1.2.7游离氨基酸的测定样品前处理:准确取腊豆样品2.0 g,研磨,使用10 mL 4%的磺基水杨酸,将其重洗至10 mL离心管中。振荡混匀,16000 r/min离心10 min,取上清液稀释后用0.45 μm滤膜过滤后上机分析。测定条件:分离柱:2.6 mm×150 mm,树脂2619#。柱温53 ℃,温度98 ℃,柱后衍生。测量波长:570,440 nm,流量0.225 mL/min,泵压110 kg/cm2[7]。

1.2.8感官评价根据食品感官评定标准,制订评分标准。实验在扬州大学扬子津东校区笃行楼感官评定实验室进行(参照国标GB/T 23493-2009),人员20人,均为食品系专业的感官鉴定人员。

1.3　数据处理

本实验中所用到的数据分析软件有SigmaPlot 10.0和SPSS 20.0。

2　结果与讨论

2.1　复合菌株发酵对腊豆pH的影响

不同比例复合菌株发酵24 h腊豆pH的结果,如图1所示。

图1　不同比例复合菌株发酵24 h腊豆的pH的比较Fig.1　Comparison of pH of 24 h Ladou fermented with different proportions of strains注：不同小写字母表示差异显著(p≤0.05)。

由图1可知,在发酵24 h时,腊豆的pH均在5.2～5.6之间。接菌组显著低于CK组(p≤0.05),且不同处理组之间存在显著差异(p≤0.05),其中1、6、10组成熟期pH显著低于其他处理组(p≤0.05),而这几组均为枯草芽孢杆菌含量较高且酵母含量较低组,配比分别为:0.6∶0.2∶0.2;0.533∶0.367∶0.1;0.467∶0.3∶0.233。在腊豆发酵过程中,微生物所产生的淀粉酶和脂肪酶,使得大豆中的碳水化合物以及脂肪分解成大量的有机酸和脂肪酸从而降低腊豆的pH,较低的pH会导致蛋白质变性,使得腊豆的组织结构更加紧密,从而增加其硬度和咀嚼性[8]。第1、6、10组的结果说明说明枯草芽孢杆菌具有更高的分解脂肪和碳水化合物的能力,对于降低pH作用更明显。低pH环境下,可以有效地抑制部分腐败微生物的生长,保证产品安全性,延长贮藏期,且各处理组的pH均在5.0以上,保证了食品内容物的平衡。

2.2　复合菌株发酵对腊豆质构的影响

腊豆发酵成熟期的质构分析,本研究选择硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性这4个指标来衡量腊豆品质,表3中为腊豆发酵24 h时各处理组的质构分析结果。

由表3可知,接菌组在成熟时期的硬度、弹性、胶黏性和咀嚼性均相对低于CK组,第6组的硬度、弹性和咀嚼性均小于其他处理组,这符合亚洲人的口感标准。发酵过程中微生物作用导致纤维素酶活性增大,纤维素降解,导致其硬度降低[9]。在发酵过程中,微生物的作用产生大量的脂肪酶,脂肪酶分解脂肪从而导致脂肪含量降低,脂肪含量与弹性呈正相关[10],所以其弹性降低。脂肪可以使得纤维容易活动,具有润滑剂和连接剂的作用,从而增加其咀嚼性[10],因此,发酵中随着脂肪含量的降低,接菌组咀嚼性也显著低于CK组。其中,第6组中枯草芽孢杆菌含量较高,说明枯草芽孢杆菌有更强的分解脂肪和纤维素的能力,与发酵腊豆pH分析地结果相一致,综合考虑,第6组更适合实际生产。

表3　复合菌株发酵对腊豆质构的影响Table 3　Texture analysis of fermentation Ladou with compound strains

注：同列不同小写字母表示差异显著(p≤0.05)。2.3复合菌株发酵对氨基态氮含量的影响

腊豆中氨基氮的含量可以反映解蛋白质的水解程度,同时氨基氮是腊豆风味物质的前体物,由不同比例复合菌株发酵24 h,腊豆中氨基态氮含量结果如图2所示。

图2　不同比例复合菌株发酵24 h腊豆氨基态氮含量的比较Fig.2　Comparison of amino nitrogen content in 24 h Ladou fermented by different proportions of strains

由图2可知,接菌组氨基态氮含量显著高于CK组(p=0.02),由质构的分析结果表明,处理组第6组质构中的硬度、弹性和咀嚼性均小于其他处理组。其中第6组中枯草芽孢杆菌含量较高,而枯草芽孢杆菌具有更好的蛋白降解能力[10],这与第6组中氨基态氮含量高的结论相一致。第6组中混菌的比例分别为0.533∶0.367∶0.1，混菌发酵更有利于实现不同酶系的互补,提高蛋白降解效率[11],枯草芽孢杆菌辅以酿酒酵母和解淀粉芽孢杆菌,可以得到较高的氨基态氮含量。

2.4　发酵腊豆游离氨基酸的分析

不同比例复合菌株发酵24 h后,腊豆中游离氨基酸的结果如表4所示。

由表4可知,不同处理组腊豆的游离氨基酸中,其中苦味氨基酸占约50%,鲜味氨基酸占30%以上,而腊豆感官并没有感觉到苦味的存在,这个和氨基酸的阈值有关,苯丙氨酸的阈值高达60 mg/100 g,谷氨酸大于30 mg/100 g才有呈味作用。且在后期香辛料的添加,高含量的盐成分可以使得咸味特征加强,且谷氨酸在酸性条件下可以和钠离子结合成谷氨酸钠,导致鲜味更加明显,从而可以掩盖苦味。腊豆在发酵期间,蛋白质在微生物和蛋白酶作用下降解为游离氨基酸,这些氨基酸是一些风味物质的前体,腊豆中蛋白质水解成短肽与腊豆滋味形成有一定关系,大量研究已表明,蛋白质水解常引起苦味的产生,这是因为蛋白水解自然形成强烈疏水的肽和氨基酸等降解产物[12],同时也会形成鲜味肽和甜味肽而弱化苦味。根据Tseng 等人对滋味特征的描述,将氨基酸分为鲜味(Asp、Glu)、甜味(Ala、Gly、Ser、Thr、Pro)、苦味(Arg、His、Ile、Trp、Tyr、Val、Leu、Cys、Lys)这三种氨基酸[13-15]。游离呈味氨基酸的构成在发酵食品的滋味形成中发挥了重要作用。由表4可知,CK组并不是氨基酸含量最低组,可能是因为一些氨基酸被微生物所利用,也可能是因为,pH较低的环境下抑制碱性蛋白酶的活性。其中第13、15、16组氨基酸含量较低,这个与所接菌株有关,这几组酵母含量都比较高,且枯草芽孢杆菌含量也不高。在所有处理组中谷氨酸含量是最高的,其次是苯丙氨酸,其中处理组5、6两组这两株氨基酸显著高于其他组分,其次甜味氨基酸中,丙氨酸含量为最高,其中第5、6、9两组含量最高,综合来看,第5、6组的发酵剂配比更适合腊豆发酵。

表4　不同比例复合菌株发酵24 h腊豆游离氨基酸的比较Table 4　Comparison of free amino acids in fermented 24 h Ladou by different proportions of strains

2.5　感官评价

不同比例复合菌株发酵24 h后,腊豆的感官评价结果如表5所示。

表5　不同比例复合菌株发酵24 h腊豆的感官评价Table 5　Sensory evaluation of 24 h Ladou fermented with different proportions of strains

由表5可知,CK组的感官评分最低,仅75.7分,而处理组中,第6组感官得分最高,其次第10、12、14、5组,这几组中,枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌含量较高,说明枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌在发酵过程中是主导作用。综合以上研究,在第6组的配比中,微生物发酵具有更强的分解脂肪和碳水化合物的能力,使得腊豆的硬度、弹性、咀嚼性适中,且在第6组中,氨基态氮含量较高,鲜味氨基酸和甜味氨基酸都高于其他组,风味较好,所以第6组更适合实际生产。

3　结论

采用Design Expert 8.06软件对3株待用菌株进行复配,研究表明,在pH这个指标上,接菌组显著低于CK组,其中第6组pH显著低于其他组(p≤0.05),低pH环境下,可以有效的抑制部分腐败微生物的生长,保证产品安全性,且延长贮藏期。此外质构受到发酵剂的影响,接菌组各项指标显著优于CK组(p≤0.05)。在氨基态氮含量方面,接菌组都优于CK组,但是游离氨基酸含量来看,CK组并没有显著低于接菌组,第6组其鲜味氨基酸和甜味氨基酸都高于其他组(p≤0.05),通过感官分析,第6组得分最高。综合考虑,选择第6组为最佳配比,第6组中,每100 g煮熟豆子接4 mL混合菌液,复合菌液的配方为枯草芽孢杆菌:解淀粉芽孢杆菌:酿酒酵母为5.33∶3.67∶1。

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