薛泽民，薛　琪，高景慧

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西杨凌　712100)

水分控制植物生长发育及其形态形成，影响植物地上与地下的协同生长及其生理反应，参与作物生物量的积累[1]。作为草食家畜主要的蛋白饲料，紫花苜蓿(Medicagosativa)产量的提升是当前中国苜蓿育种的热点[2]。佟长福等[3]研究苜蓿叶水势、蒸腾速率在不同灌溉水平下的日变化规律及其与土壤含水率和气象因素之间的关系，建立叶水势和蒸腾速率与气象因素间的定量关系式。刘玉华等[4]研究旱作条件下紫花苜蓿光合蒸腾日变化与环境因子之间的关系，认为对光合蒸腾特性起主要决定作用的因子是光和有效辐射，主要限制因子是大气温度。

在干旱条件下，胞间CO2浓度发生变化，使细胞气孔大小改变，降低蒸腾作用的水分散失，造成光合作用变化而影响地上和地下部分生长，在中、重度干旱时，会造成作物急速减产甚至死亡[5-6]。气孔影响苜蓿蒸腾作用，对其抗旱能力有显著的调节作用[7]。脱落酸ABA(Abscisic acid)调节植物气孔的关闭，参与植物逆境相关的各种生理生化过程[8]。2009年拟南芥(Arabidopsis)ABA受体(Receptor)的发现和分子功能的验证，为ABA信号通路的逆境研究提供理论基础[9]。ABA受体复合体ABA/PYL/PP2C引起气孔关闭，调控ABA信号通路，影响植物的抗旱能力[10]。pRD29A:PYL9具有极强的抗旱能力和快速感受水分胁迫的能力[11]。ABA受体PYL8和PYL9分别互作MYB77和MYB44，调控植物缺水时的向水性[12]，在水稻中过表达PYL5则能够增强其抗旱能力[13]。目前，苜蓿ABA抗逆的研究多集中于生理方面，而有关ABA受体与渗透胁迫间关系的研究则鲜有报道[14]。

本试验以不同品种紫花苜蓿为研究材料，对其渗透胁迫下生长及生理指标进行测定，研究渗透胁迫下苜蓿ABA受体基因的表达情况，以期为今后苜蓿ABA受体在干旱逆境中的应用及抗逆育种提供科学依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

紫花苜蓿品种：‘三得利’(Sanditi)、‘赛迪5’(Sardi 5)由百绿国际草业公司引进，‘新牧2’(Xinmu 2)由新疆农业大学草业工程学院育成，购自杨凌金道种子公司。‘WL656’‘WL168’‘WL903’‘WL712’‘WL343’为美国进口品种，购自北京正道公司。

1.2　试验方法

1.2.1幼苗培养试验于2016年11月在西北农林科技大学动物科技学院草业科学实验室进行。挑选整齐一致完整的紫花苜蓿种子，用φ=5% NaClO进行种子消毒，浸泡30 min，期间每隔10 min搅拌1次，最后用蒸馏水冲洗3～4次，并用吸水纸吸干残留水分。在121 ℃下对培养皿进行高压灭菌，持续40 min。将消毒种子均匀地摆在垫有滤纸的培养皿中，每个培养皿50粒种子，于(25±1)℃、1 500 lx(12 h/d)的光培养箱中萌发。待2片子叶完全展开时选择健康、生长一致的幼苗进行移栽，1/4 MS营养液培养。幼苗第3片真叶完全展开时对幼苗进行处理，每个处理设3个重复，处理时间分为3、5、7 d。处理为对照(CK)：1/2 MS营养液；胁迫(TM)：1/2 MS营养液+150 g/L PEG-6000。

1.2.2幼苗指标测定及方法幼苗处理3、5、7 d后测定以下指标。根长和苗长：用根系扫描仪扫描植株，再利用winRHNZOR分析软件进行测定，每处理测定5株，取均值；相对含水量(RWC)：采用烘干法测定[15]，分别测定其鲜质量(FW)，饱和鲜质量(SFW)，干质量(DW)，其中，RWC=(FW-DW)/(SFW-DW)；鲜干比(FW/DW)；脯氨酸质量分数：采用酸性茚三酮法测定[16]。

1.2.3ABA受体基因的表达测定苜蓿幼苗总RNA提取采用Trizol法。cDNA采用Takara反转录试剂盒合成。反应条件：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。Real-time PCR内参基因为ACTINα，反应程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环。ABA受体基因的PCR反应程序与内参基因相似。所用引物由杨凌保新公司合成，引物序列见表1。

1.3　数据处理

试验数据用Excel 2007整理，数据用“平均值±标准差”表示，采用PASW statistics18进行差异显著性分析。

表1　基因和引物序列Table 1　Genes and sequences of primers

2　结果与分析

2.1　150 g/L PEG处理对紫花苜蓿幼苗生长的影响

2.1.1紫花苜蓿幼苗的地下生长由图1可知，与CK相比，干旱胁迫下不同品种第5、7天的根长都呈下降趋势。其中，下降最大是‘三得利’，分别下降16.09%和15.88%(P<0.05)；下降最小是‘WL168’，分别下降1.23%和10.58%(P<0.05)。不同品种CK幼苗根长第7天比第3、5天增加。其中，增加最大的是‘WL168’，分别增加15.12%和12.52%(P<0.05)；增加最小是‘三得利’，分别增加9.18%和1.33%(P<0.05)。不同品种TM幼苗根长变化差异不显著。表明干旱胁迫可以显著抑制苜蓿的地下生长。

2.1.2紫花苜蓿幼苗的地上生长由图2可知，与CK相比，干旱胁迫下第5、7天不同品种苗长都呈下降趋势。其中，下降最大是‘三得利’，分别下降23.22%和23.71%(P<0.05)；下降最小是‘WL168’，分别下降10.48%和18.06%(P<0.05)。不同品种CK苗长第7天比第3、5天增加。其中，增加最大是‘WL168’，分别增加20.18%和11.33%(P<0.05)；增加最小是‘三得利’，分别增加11.49%和4.30%(P<0.05)。不同品种TM苗长变化差异不显著。表明干旱胁迫可以显著抑制苜蓿幼苗地上部分的生长。

“*”表示差异显著(P<0.05)，下图同　“*”Significant difference in the same bar(P<0.05).The same below

图2　150 g/L PEG处理下紫花苜蓿幼苗植株的生长Fig.2　Stem length of alfalfa under 150 g/L PEG stress

2.1.3紫花苜蓿鲜干质量比植物的鲜干质量比反映干物质积累程度。由图3可知，干旱胁迫下第5、7天不同品种鲜干比显著低于CK。其中，降低最大是‘三得利’，较对照分别下降36.41%和37.81%(P<0.05)；降低最小是‘WL168’，分别下降18.71%和24.51%(P<0.05)。不同品种TM幼苗鲜干比第7天比第3、5天下降，下降最多是‘WL168’，分别下降27.03%和10.60%(P<0.05)；下降最小的是‘三得利’，分别下降17.58%和5.45%(P<0.05)。不同品种CK幼苗鲜干比变化差异不显著。表明干旱胁迫下，植物可能通过降低鲜干比来储存营养物质，度过干旱时期。

2.1.4紫花苜蓿叶片相对含水量由图4可知，与CK相比，干旱胁迫下第5、7天不同品种叶片相对含水量都呈下降趋势。其中，下降最大是‘三得利’，分别下降15.01%和16.71%(P<0.05)；下降最小是‘WL168’，分别下降7.66% 和13.31%(P<0.05)。不同品种CK幼苗相对含水量变化差异不显著。不同品种TM幼苗相对含水量第7天比第3、5天显著降低，下降最多是‘WL168’，分别降低11.56%和6.95%(P<0.05)；下降最小是‘三得利’，分别降低8.47%和2.75%(P<0.05)。表明干旱胁迫下，苜蓿通过降低体内水分含量来降低蒸腾，对苜蓿抵抗干旱有重要作用。

图3　150 g/L PEG处理下紫花苜蓿幼苗鲜干比Fig.3　Fresh-dry ratio of alfalfa under 150 g/L PEG stress

图4　150 g/L PEG处理对紫花苜蓿幼苗相对含水量Fig.4　Relative water content of alfalfa under 150 g/L PEG stress

2.1.5紫花苜蓿幼苗脯氨酸质量分数由图5可知，与CK相比，干旱胁迫下第5、7天不同品种脯氨酸质量分数都呈上升趋势。其中，增加最大是‘WL168’，分别增加24.47% 和39.04%(P<0.05)；增加最小是‘三得利’，分别增加15.39%和21.24%(P<0.05)。不同品种CK幼苗间脯氨酸质量分数变化差异不显著。不同品种TM幼苗第7天比第3、5天显著增加，增加最大的是‘WL168’，分别增加27.45%和12.02%(P<0.05)。增加最小是‘三得利’，分别增加19.55%和9.60%(P<0.05)。表明干旱胁迫下，苜蓿能够通过增加体内脯氨酸来调节体内代谢，应对外界胁迫。

图5　150 g/L PEG处理下紫花苜蓿幼苗脯氨酸的质量分数Fig.5　Proline mass fraction of alfalfa under 150 g/L PEG stress

通过以上研究，发现抗干旱胁迫最强是‘WL168’，干旱胁迫对其根长、苗长、鲜干比和相对含水量的影响最小，其脯氨酸质量分数最高，抗旱性最强。抗旱性最弱是‘三得利’。各品种抗旱性强弱为：‘WL168’>‘新牧2’>‘WL712’>‘赛迪5’>‘WL343’>‘WL656’>‘WL903’>‘三得利’。

2.2　ABA受体基因表达

蒺藜苜蓿为豆科模式植物，含有ABA受体9种，如图6所示，检测PEG干旱胁迫处理下，抗旱苜蓿品种‘WL168’幼苗ABA受体基因( Medtr1g016480、 Medtr1g028380、 Medtr3g071740、 Medtr3g090980、 Medtr4g014460、 Medtr5g030500、 Medtr5g083270、 Medtr7g070050和 Medtr8g027805)在根茎叶中的相对表达量。根据试验设计，本试验中对照组目的基因的相对表达量为1。结果显示：苜蓿品种‘WL168’的9个ABA受体基因在干旱条件下， Medtr1g016480和 Medtr5g083270的相对表达量显著高于其他基因，二者在根茎叶中表达量分别为6.10、1.79、3.04和6.51、1.67、1.89，与CK相比分别提高510.3%、79.1%、204.3%和551.2%、67.4%、89.5%；其表达量强弱为：根>叶>茎。说明干旱胁迫下ABA受体基因调控苜蓿幼苗产生ABA主要作用在根和叶中，根首先感受到环境变化产生ABA信号，茎起到传输作用，ABA信号在叶中积累。表明在渗透胁迫下，苜蓿通过 Medtr1g016480和 Medtr5g083270表达量的提高来调节体内生理和生长变化，从而度过干旱逆境。

图6　150 g/L PEG处理下紫花苜蓿幼苗ABA受体基因表达Fig.6　Expression of ABA receptor gene of alfalfa under 150 g/L PEG stress

3　讨 论

渗透胁迫对植物生理以及生长的影响非常复杂，研究植物在渗透逆境下的生理反应，有助于更好地理解植物生长与环境胁迫之间的相互关系，也对研究植物生理性状有重要意义。植物的抗旱性是植物长期适应环境形成的一种抗旱机制，是对干旱环境的抵抗能力，是多重因素相互作用形成的综合性状。抗旱性在本质上都与外界环境的每个因子存在一定联系[17-19]。幼苗期是植物生长的一个重要阶段，这一时期，植物对外界水分条件比较敏感，水分胁迫不仅对植物幼苗的生存有一定威胁，还对后期植物的生长发育造成影响，使植物地上和地下生长受到抑制。王珊等[20]认为干旱胁迫下桔梗地上部分和地下部分干质量下降，抑制生物量的积累；周雪洁等[21]对干旱胁迫下甘草幼苗生理特性的研究发现其相对含水量在胁迫3 d后显著减少；刘继明等[22]认为干旱条件下小蓬竹幼苗体内脯氨酸质量分数升高，且随干旱条件的加剧，脯氨酸质量分数持续积累。本试验结果也表明150 g/L PEG-6000渗透胁迫下不同品种紫花苜蓿地下部分根的生长受到显著抑制，并且随着胁迫时间延长，植物也对渗透胁迫产生响应，苜蓿的地上部分生长也受到抑制，使其苗长缩短，鲜干比下降，相对含水量显著降低；但其叶片中脯氨酸质量分数显著升高，提高苜蓿对干旱的抵抗能力。‘WL168’在渗透胁迫下根长、苗长、鲜干比和相对含水量变化最小，脯氨酸质量分数增加最大，为最抗旱品种。

ABA是植物体内一种重要激素，它对植物抵抗逆境胁迫有重要作用。大量研究表明，当植物受到外界环境胁迫时，植物体内会迅速积累大量ABA。逆境胁迫能够增加叶绿体膜对ABA的通透性，并使根系快速合成ABA运输至叶片[23-25]。ABA能够调节气孔开闭，减少蒸腾失水从而缓解干旱，同时它还能引起相关基因表达，这对植物抵抗逆境起关键作用[26]。本试验通过检测干旱胁迫下9种受体基因的表达，发现 Medtr1g016480和 Medtr5g083270的表达量显著高于其他基因，表明 Medtr1g016480和 Medtr5g083270在ABA调控系统中起重要作用，苜蓿通过 Medtr1g016480和 Medtr5g083270的表达来调控植物抵抗外界环境胁迫。渗透胁迫下，植物根系最先对干旱胁迫作出响应，主要通过生长抑制、渗透调节、膜结构与功能改变及活性氧等次生代谢物的合成来调节[27-28]。本试验结果也表明，渗透胁迫下9种ABA受体基因在体内表达顺序为根>叶>茎。说明在干旱条件下，植物先在根中产生ABA信号，通过茎的运输，最后在叶中积累。

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