王　怡，范　琪，于月华，梁承娟，陈全家，曲延英，倪志勇

(新疆农业大学 农学院，乌鲁木齐　830052)

TCP蛋白是植物特有的一类转录因子，包含1个TCP结构域，含59个氨基酸(AA)残基的螺旋-环-螺旋(bHLH)，可以与DNA 结合或者与蛋白质互作[1-2]。在许多植物物种中TCP蛋白进化保守，并且参与植物从种子萌发到营养生长直至形成花和果实的过程。TCP转录因子是重要的生长调节物质，能够将多种内源性和环境信号转化为生长调节剂。根据氨基酸序列的差异，TCP转录因子可以分为2类(Ⅰ和Ⅱ)，Ⅰ类蛋白相比Ⅱ类蛋白在TCP结构域中有4个氨基酸的缺失[3]，这2类TCP蛋白已被证明能够识别靶基因的富含GC含量的启动子序列[1,4-6]。高等植物的转录因子转录激活区通常富含酸性氨基酸序列区域、谷氨酰胺区域以及脯氨酸结构区域[7]。目前，许多TCP蛋白能够作为激活子或抑制子调控靶基因的转录水平表达。

基因沉默是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段，人工miRNA技术是通过内源miRNA序列结构特征产出21 bp目的miRNA，替换内源miRNA前体的miRNA-miRNA*的序列[8]。MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22个核苷酸的内源单链非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA上的互补位点结合来介导mRNA的降解或翻译抑制[9]，从形成茎环结构的单链RNA前体中产生[10-11]。小RNA不仅来源于外源核酸，如病毒和转基因，而且来源于内源性基因位点，作为一类重要的转录后基因调控因子，近年来的大量研究揭示了miRNAs在调控植物生长发育以及环境适应性方面广泛且关键的作用[10,12]。Khraiwesh等[13]以缺失 DICER-LIKE1b基因小立碗藓突变体为材料，对miRNA丰度进行研究表明，成熟miRNA的靶mRNAs不仅没发生切割，而且靶mRNAs的转录本水平也明显降低。其原因是这些突变体积累miRNA，形成靶标RNA双联体，接着编码靶mRNAs的基因过度甲基化，最后发生沉默。本研究构建海岛棉 GbTCP5基因沉默和过量表达植物表达载体并转化拟南芥，为深入研究海岛棉 GbTCP5基因的生物学功能奠定基础。

1　材料与方法

1.1　海岛棉 GbTCP5基因植物过量表达载体的构建

1.1.1植物材料哥伦比亚野生型拟南芥col-o(Arabidopsisthaliana)由新疆农业大学植物逆境分子生物学实验室保存。

1.1.2质粒及菌株质粒pCAMBIA3301提供载体骨架，含有 GbTCP5基因的克隆载体pGEM-T Easy和根癌农杆菌菌株(GV3101)均由新疆农业大学植物逆境分子生物学实验室保存。

1.1.3海岛棉 GbTCP5基因的PCR扩增及植物表达载体的构建使用带有酶切位点BglⅡ和PmlⅠ的引物，以质粒pGEM-T Easy-GbTCP5为模板，利用TransStartTMTaqDNA Polymerase进行PCR扩增，扩增程序参照说明书。引物序列为3301-GbTCP5-F:5′GAAGATCTTCATGA- TCTCGAGTTCAAGGGAAGC3′；3301-GbTCP 5-R:5′CGCACGTGCGTCATCGTTTTGTGTATGAGTGAGGC3′(下划线表示酶切位点)。利用限制性内切酶BglⅡ和PmlⅠ对载体pCAMBIA3301和基因片段双酶切后再进行连接，双酶切体系如下：BglⅡ和PmlⅠ各1 μL，质粒模板10 μL，10×buffer 5 μL，补充水至50 μL，37 ℃水浴1 h。连接体系参照相关说明书。采用菌液PCR的方法鉴定获得阳性克隆，通过测序验证载体构建的正确性。提取植物表达载体pCAMBIA3301-GbTCP5质粒，利用冻融法转入农杆菌GV3101，菌液PCR检测。

1.1.4拟南芥转化及鉴定利用农杆菌浸染法将pCAMBIA3301-GbTCP5转化拟南芥col-o野生型，收获转化后的拟南芥植株种子，将T0代收获的种子均匀撒播于混合土[V(营养土)∶V(蛭石)∶V(珍珠岩)=1∶1∶1]中，培养至长出2片叶片时，喷除草剂进行阳性植株筛选。抗性植株可能为T1代植株。

1.2　海岛棉 GbTCP5基因沉默表达载体的构建

利用在线网站WMD3(http://wmd3.weigel world.org/cgi-bin/web app.cgi? page=Oligo;project=stdwmd)设计置换PCR引物，扩增GbTCP5的miRNA和miRNA*序列。在拟南芥At-MIR319前体扩增引物319-3301-F/R两端分别添加NcoⅠ和BglⅡ限制性内切酶位点，以便亚克隆至植物表达载体pCAMBIA3301中，引物序列为TCP5-I miR*s GATTTATCTCTGTCACCTGGCATTCTCTCTTTTGTATTCC；TC P5-II miR*a GAATGCCAGGTGACAGAGAT- AAATCAAAGAGATCAATGA；TCP5-III miR*sGAATACCAGGTGACACAGATAATTCAC-AGGTCGTGATATG；TCP5-IVmiR*a GAATTATCTGTGTCACCTGGTATTCTACATAT-ATTCCT。

以At-miR319-pGM-T质粒为模板，使用TransStartTMTaqDNA聚合酶，用319-3301-F和TCP5-IVmiR*a，TCP5-IIImiR*s和TCP5-IImiR*a，TCP5-ImiR*s和319-3301-R 3组引物分别扩增a、b、c片段，凝胶回收3条条带，用3条条带的混合物为模板，使用TransStartTMTaqDNA 聚合酶，用319-3301-F/R引物扩增置换后的amiRNA的前体片段，PCR扩增体系和程序参照Schwab等[14]的方法。凝胶回收amiRNA前体片段，通过TA克隆，连接至pGEM-T Easy载体中，经菌液PCR和测序验证amiRNA前体序列的正确性。

利用限制性内切酶NcoⅠ和BglⅡ对amiRGbTCP5-pGEM-T Easy和载体pCAMBIA3301双酶切后并连接，酶切连接体系参照说明书，经菌液PCR和测序检测载体构建的正确性。

2　结果与分析

2.1　 GbTCP5基因植物过量表达载体的构建

PCR扩增 GbTCP5片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，产物扩增大小945 bp(图1左)。将pCAMBIA3301-GbTCP5转化农杆菌GV3101，经过菌液PCR鉴定(图1右)，表明该植物表达载体成功转入农杆菌GV3101中。

M1.DL2000 marker;1.pCAMBIA3301-GbTCP5；M2.DL2000 marker;1～8.农杆菌菌液PCRAgrobacteriumtumefaciensliquid PCR

图1pCAMBIA3301-GbTCP51PCR产物电泳分析(左)和pCAMBIA3301-GbTCP5表达载体的农杆菌菌液PCR鉴定(右)
Fig.1ElectrophoresisanalysisofGbTCP5-pCAMBIA3301(left)andPCRidentificationofAgrobacteriumtumefaciensexpressingvectorpCAMBIA3301-GbTCP5(right)

2.2　转 pCAMBIA3301- GbTCP5基因拟南芥的筛选和检测

除草剂喷洒结果表明，获得了抗除草剂的转基因植株(图2)。Bar基因和目的基因PCR检测表明，成功获得了转基因拟南芥植株(图3)。

图2　转基因拟南芥筛选Fig.2　Screening of transgenic Arabidopsis

M1.DL2000 marker；M2.DL2000 marker；1～7.不同株系转基因拟南芥植株PCRTransgenicArabidopsisthalianPCR

图3转基因拟南芥PCR
Fig.3TransgenicArabidopsisbacteriaPCR

2.3　 GbTCP5基因植物沉默表达载体的构建

利用置换PCR的方法，分别获得置换 At-MIR319的miRNA和miRNA*序列的 amiRGbTCP5 3个片段a、b、c，大小分别为118、176和178 bp(图4左)。以a、b、c 3个片段混合为模板进行PCR扩增获得大小为422 bp的 amiRGbTCP5前体序列(图4右)。

将 amiRGbTCP5前体序列亚克隆至pGEM-T Easy载体中，菌液PCR和测序结果表明获得了替换 At-MIR319的miRNA和miRNA*序列的amiRGbTCP5。菌液PCR(图5右)和测序结果表明获得amiRGbTCP5-pCAMBIA3301重组质粒。

M1.DL2000 marker；a、b、c amiRGbTCP5片段PCR产物M2.DL2000 marker；1. amiRGbTCP5前体序列

图4amiRGbTCP5片段PCR产物(左)和amiRGbTCP5前体序列PCR产物(右)
Fig.4amiRGbTCP5fragmentPCRproduct(left)andamiRGbTCP5precursorPCRproduct(right)

M1.DL2000 marker；1～6.amiRGbTCP5-PGEM-T Easy PCR产物amiRGbTCP5-PGEM-T PCR product;M2.DL2000 marker；1～7.amiRGbTCP5-pCAMBIA3301重组质粒菌液PCR菌液amiRGbTCP5-pCAMBIA3301 recombinant plasmid PCR

图5PCR检测amiRGbTCP5-PGEM-T重组质粒(左)和PCR检测amiRGbTCP5-pCAMBIA3301重组质粒(右)
Fig.5PCRdetectionofrecombinantplasmidamiRGbTCP5-PGEM-TEasy(left)andPCRdetectionofrecombinantplasmidamiRGbTCP5-pCAMBIA3301(right)

3　讨 论

TCP基因是由玉米(Zea)的 TEOSINTE BRANCHED1(TB1)、金鱼草(Antirrhinum)的 CYCLOIDEA(CYC)，水稻(Oryza)中的 PROLIFERRATING CELL FACTORS 1(PCF1)和 PROLIFERRATING CELLFACTORS 2(PCF2)的第1个英文字母构成了它的名字TCP[15]。TCP转录家族已在许多植物中被发现，并且它们在植物的生长发育、形态建成以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用[16]。在许多基因表达的转录调控机制中，转录因子被认为是非常重要的。转录因子可以与特定的DNA结合结构域结合，激活或抑制相关基因转录[17-19]。

前人研究发现一些TCP转录因子参与调控棉花纤维的发育进程。例如，Hao等[20]从海岛棉纤维cDNA文库中克隆了1个GbTCP转录因子，在拟南芥中过表达GbTCP基因，能够增强根毛的起始和伸长，调控分支；进一步研究显示GbTCP正调控茉莉酸水平，且激活纤维和根毛伸长必需的一些下游基因表达。这些结果表明，GbTCP是一个纤维和根毛发育相关的重要转录因子。Wang等[21]发现在拟南芥中异源表达 GhTCP14导致生长素水平和分配发生改变，影响根和表皮细胞的起始和伸长。以上研究表明TCP基因在棉花纤维伸长中具有重要的作用。本研究构建海岛棉 GbTCP5过量表达载体并转化拟南芥，得到转基因植株，对该基因功能的研究具有重要的价值。

重叠延伸PCR技术已被广泛应用，不仅可以应用于扩增长片段基因、定点突变和基因敲除等，而且在定点突变上的应用具有突变效率高、操作简单、成本低等优点[22]。运用人工miRNA技术构建植物表达载体可以使其他物种的miRNA在模式植物拟南芥中产生[14]。本研究利用重叠延伸PCR构建 GbTCP5基因沉默表达载体，为进一步分析该基因功能奠定了坚实的基础。

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