唐　婕,李晶晶,王　波,索丽娟,李斐然,刘文华,王　艳,严兴荣

(1.陕西省动物研究所，西安　710032; 2.西北大学 生命科学学院，西部资源与生物技术教育部重点实验室，西安　710069；3.秦岭珍稀濒危动物保育重点实验室，西安　710069)

野生动物是维持全球生物多样性的重要组成部分，对野生动物的保护也成为中国一项基本国策。目前，根据野生动物现有数量制订不同保护级别，如秦岭6宝(大熊猫、金丝猴、羚牛、朱鹮、林麝和金钱豹)均列为国家一级保护动物，其中雄性林麝分泌的麝香具有重要的药用价值， 在医药行业有“软黄金”之称。早期麝香主要来自野外捕杀的雄麝，雌性林麝除没有外露的獠牙以外，外观与雄麝没有区别，捕杀雄麝的同时，雌麝也遭殃，这导致林麝数量逐年减少[1]。为了保护其宝贵的种质资源，人工圈养的方法逐渐被推广，目前陕西省凤县人工圈养林麝超7 000只[2]。随着养殖技术的不断改进，人工圈养林麝数量也呈明显上升趋势。圈养林麝数量虽然不断增加，但其遗传多样性却不断降低，目前尚无有效的遗传多样性监控手段。DNA提取是进行遗传学检测的基础，如何保证在无损伤条件下大量采集林麝DNA，是林麝养殖技术的关键环节。林麝天性胆小，任何人为干扰都会造成应激，可能会影响林麝生产性能[3]。自然掉落的毛发和粪便是提取DNA常用样本，但林麝自然掉落的毛发没有毛囊，影响DNA获得效率。如要获得带有毛囊的毛发，这就需要对林麝进行抓捕拔毛，但这会对其造成不必要的应激反应[4-5]。粪便是林麝的排泄物，可在不干扰林麝自身活动的条件下获得样本。野生林麝粪便采集同样是种质资源监控和保护的一部分，野生林麝粪便采集困难，新鲜粪便的采集就更难。粪便排泄后多长时间能有效提取DNA，这是本研究工作之一。传统粪便DNA提取采用商品化的专用提取试剂盒进行[6]。这种方法获取DNA的成本高，不利于大量样品分析。本研究改进原有方法，结合普通细胞DNA提取试剂盒进行提取，比较和探索两种方法提取林麝粪便DNA以及粪便排泄后不同时间DNA提取效率，为后续林麝遗传监控中DNA提取奠定基础。

1　材料与方法

1.1　动 物

林麝在陕西省宝鸡市凤县周家庄村蒋家沟陕西省动物研究所林麝野外科学研究基地进行饲养。海拔1 300～1 500 m，一天饲喂两次，自由饮水采食(主要以天然树叶为主，瓜果及胡萝卜为辅)。

1.2　粪便采集

清晨5点在圈舍内收集新鲜粪便样本，用天平称取0.5 g置于5 mL EP管，分为4组，在室温下放置0、2、4、6 d，备用。提取DNA前对粪便外观和形态进行观察和拍照。野生林麝粪便采自太白县黄柏源处。

1.3　DNA提取

对照组DNA提取：粪便DNA用FastDNA SPIN Kit for Feces (11657022, MP, USA)进行提取，按照说明书进行操作，具体参照以前的研究报道[7]。

试验组DNA提取：相同数量的粪便添加3 mL 磷酸缓冲液静置1 min，剧烈震荡30 s， 充分吸出液体部分，2 000 r/min离心10 min，接下来用普通细胞DNA提取试剂盒[Biospin Cell Genomic DNA Extraction Kit (BSC05S1, Bioflux, Shanghai)]进行提取，最后将提取的DNA溶液置-20 ℃冰箱，备用。

1.4　PCR扩增

对照组和试验组提取的DNA用PCR扩增试剂盒进行扩增，具体操作参照以前的研究报道[8]。以林麝甘油醛-3-磷酸基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为模版，用primer 5.0设计引物，在北京奥科生物技术有限公司进行合成。引物序列如下：forward: 3′-TCACCGAGGCTGCTTTTAAT-5′, reverse: 3′-GATCTCGC TCCTGAGAGATG-5′。扩增用20 μL体系，其中DNA模版0.3 μL，上下引物各0.6 μL，添加无菌ddH2O至10 μL， 添加2×PCR mix 10 μL，混匀，4 000 r/min离心30 s。用博日PCR扩增仪(TC-XP，Hangzhou，China)进行扩增，扩增条件：94 ℃ 5 min，进入循环95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增的DNA用琼脂糖凝胶电泳分离，结果用凝胶成像系统(Champhemi Top 610, Saizhi,Beijing,China)进行观察并用分析软件(Lane 1D Analysis Software, Saizhi, Beijing, China)对DNA条带进行分析，测量DNA条带的光密度值(DNA条带光密度与DNA量呈正相关)，以0 d的光密度值为参考，其他时间点的光密度值与之相比，获得相对光密度值。

1.5　统计学方法

所有试验独立重复3次，数据用“平均数±标准差”表示，用Spass 13.0软件进行统计分析，通过t检验进行显著性统计分析。

2　结果与分析

2.1　空气暴露影响林麝粪便的形态变化

如图1所示，健康新鲜林麝粪便表面为光滑的不规则圆形或椭圆形，水分饱满，光泽性强(图1-A)；2 d后表面变得粗糙无光泽，部分区域出现塌陷(图1-B)。4 d后粪便表面塌陷部位增多，表面形态没有变化(图1-C)；6 d后表面比较粗糙，表面塌陷部分比4 d多(图1-D)。由于在空气中直接暴露，粪便表面水分开始丢失，表面由于水分减少，外观没有光泽，粪便表面没有水分的支撑开始凸凹不平，外观粗糙。随着时间延长，外部水分丢失的同时，内部水分开始丢失，粪便开始皱缩，体积变小。

新鲜粪便 (A) 和分别在空气暴露2 d (B)、4 d (C)和6 d (D)的粪便
Fresh feces (A) and feces was exposed in air for 2 d (B), 4 d(C) and 6 d (D) (bar =1 cm)

图1粪便在空气中暴露不同时间
Fig.1Differentexposuretimeofmuskdeerfecesinair

2.2　对照和试验组均可提取粪便DNA

对照组和试验组的方法均可有效提取林麝DNA(图2-A,2-B)，但试验组提取DNA的量显著高于对照组 (P<0.05)。与对照组相比，试验组的方法可显著提高DNA提取效率，每个样本能节省1 h左右时间。对照组用的是常规粪便总DNA提取试剂盒，需要对粪便研磨和反复离心的复杂操作，富集粪便总DNA，所用时间较长，同时复杂的操作可能会造成总DNA丢失。试验组的方法，用PBS冲洗粪便表面的林麝细胞和微生物，减少粪便的研磨和复杂的程序，用细胞DNA提取试剂盒直接提取，所用时间明显减少。

2.3　粪便放置时间延长可降低两种方法提取DNA的效率

两种方法均可有效提取不同空气暴露时间的粪便DNA，DNA量均随时间延长逐渐减少，但差异不显著(P>0.05)(图2-B,3-B)。空气暴露2 d和4 d，试验组获得的DNA量显著上升(P<0.05)，6 d回到正常水平(图2-B)；对照组仅在2 d 提取的DNA量上升 (P<0.05)，而4 d 和6 d显著下降到正常水平(图3-B)。每个时间点试验组获得的DNA显著高于对照组(P<0.05)。粪便成分复杂，除肠道上皮细胞外，还有复杂的微生物。粪便在体外直接空气暴露，粪便微生物进一步扩增，同时也可能对粪便内肠道细胞进行破坏和分解，导致细胞数量下降，因此两种方法提取DNA的量在第6天均呈下降趋势。由于粪便表面水分丢失快于粪便内，粪便内的微生物扩增可能较表面快。微生物对肠道上皮细胞的破坏速率与微生物的扩增呈正相关，本研究提取DNA的效率也证明这一点。

2.4　两种方法可用于野外林麝粪便DNA提取

如图3所示，本研究用野外采集的1份林麝粪便样本，从外观判断排粪时间超过7 d，用两种方法提取DNA，均可有效获取DNA，但试验组提取粪便DNA的量显著高于对照组(P<0.05)。野外林麝粪便由于采集时间不确定，外形容易与其他种类动物如黄羊、斑羚的粪便相混。因此需要进行PCR进行确定。野外粪便空气暴露的时间较长，需要用可靠的方法进行DNA提取，由于试验组的方法仅用粪便表面的肠道上皮细胞，进一步说明试验组方法在野外成颗粒状粪便DNA提取的可靠性。

对照组 (A) 和试验组 (B) 提取粪便DNA的PCR产物条带；粪便不同空气暴露时间对照组 (C) 和试验组 (D)两种方法提取DNA的相对量；每个时间点对照组和试验组DNA相对含量比较 (D)
Bands of PCR production of DNA were presented by control (A) and treated (B) methods. Relative quantity of DNA was showed by control (C) and treated (D) methods for different time of air exposure. Relative quantity of DNA was presented between control and treated methods at each time point (E)

图2两种方法提取笼养林麝粪便DNA的效率
Fig.2EfficiencyofDNAextractionofcagedforestmuskdeerfecesbytwomethods

3　讨 论

种质资源调查和遗传多样性检测离不开动物DNA样本的采集，在不影响动物活动的前提下采集DNA样本是最佳选择[9]。尿液和粪便是动物排泄物，可在不近距离接触动物的前提下采集。尿液理论上是最佳的样本选择，尿液中动物尿道细胞比较纯，有研究用尿液培养出细胞[10]。因此，尿液也可提取DNA并且可避免大量细菌微生物的干扰。牛羊等动物尿液排泄较多且地点固定，可大量收集。林麝等野生动物常在野外，并且排尿少，即使在圈舍，排尿和排粪常在同一位点，很难获得质量好的尿液，所以尿液的采集对于野生动物很难适用。粪便是固体，在野外和养殖场所均容易采集，但粪便DNA的提取容易受到粪便细菌DNA的影响。如何减少粪便细菌DNA的影响提高动物DNA纯度，是目前亟待解决的问题。粪便DNA提取用于野生动物微卫星检测、遗传标记和物种野外调查等研究，因此粪便是野生动物DNA采集所需的重要样本。粪便DNA提取主要用粪便提取试剂盒，也有研究对粪便样本DNA提取程序进行优化，但这些方法提取的是粪便总DNA[6,11]。本研究同样用粪便DNA提取试剂盒也能有效提取林麝粪便DNA，但耗时耗力。林麝粪便在直肠颗粒化后在肠道中移行，因此粪便表面携带的肠道上皮细胞比其内部多。通过试验组方法，直接收集粪便表面的细胞来提取DNA，也可达到相同的效果。粪便在空气中暴露可影响林麝DNA样本的提取。粪便在空气中长时间暴露，可导致粪便脱水。季节不同，粪便在空气中暴露时间不同，形态也有差异。这方面研究报道较少，本研究发现林麝粪便空气中长期暴露，影响林麝DNA的提取，这可能是粪便空气暴露时间延长，导致肠道微生物破坏粪便内外的肠上皮细胞所造成的。

两种方法(对照组和试验组)提取DNA的PCR产物条带 (A)，两种方法提取DNA的PCR产物相对量 (B)
Bands of PCR production of DNA extraction were presented (A), relative quantity of PCR production with two methods was shown (B)

图3野生林麝粪便的DNA提取
Fig.3ExtractionofDNAfromfecesofwildforestmuskdeer

本研究用试验组的方法可显著减轻粪便DNA提取的工作量，粪便在空气暴露时间过长可影响DNA提取效率，空气暴露4 d内均可有效提取粪便DNA，这些研究为后续大样本粪便DNA的提取提供参考。

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