王亚楠(综述) 方 浩,2(审校)

(1复旦大学附属中山医院麻醉科 上海 200032; 2复旦大学附属金山医院麻醉科 上海 200540)

随着人口的老龄化,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、脑中风、术后认知功能障碍等疾病的发生率越来越高,神经炎症是这些中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病的一个共同特征。近年来有较多研究发现缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)在神经炎症中起着重要的作用并且能够影响神经功能,但是其具体的作用机制还未确定。本文基于已有的研究对Cx43与神经炎症的关系及其对神经功能的影响作一总结,为临床上CNS疾病的治疗提供新的思路。

缝隙连接蛋白43的结构及功能1986年Paul克隆测序出第1个缝隙连接蛋白(connexin,Cx),至今在人类和鼠类中发现至少分别有20个和19个成员。Cx依据其分子量大小进行命名,如Cx43的相对分子质量为43 000。Cx43是含有4个跨膜域的高度调节的内在膜蛋白,它包括2个细胞外环、1个胞质环及胞质氨基(-NH2)和羧基(-COOH)。羧基端在长度上差异很大,被认为是发挥主要调节功能、提供蛋白-蛋白相互作用的区域[1]。半通道(hemichannel,HC)是由Cx43组成的六聚体结构,介导细胞内外的信息交流。相邻两细胞的HC对合形成缝隙连接(gap junction,GJ),介导细胞间的信息交流。Cx43广泛分布于身体的各个部位,如心、脑、肺、毛细血管等[1-2]。在脑中共有11种Cx,其中含量最多的是Cx43,主要分布于星形胶质细胞,也少量表达于小胶质细胞,几乎不分布于神经元[3]。

Cx43的功能与其形成的GJ和HC密切相关。生理情况下GJ处于开放状态。GJ允许小分子细胞间被动扩散,如:谷氨酸、谷胱甘肽、糖、ATP、离子(如Ca2+、Na+、K+)[4]。Cx43是星形胶质细胞中含量最多的Cx,而星形胶质细胞在正常的神经活动中起主要作用,它们为神经元提供代谢和结构支持,控制细胞外谷氨酸、钾、氢离子浓度,调节细胞外液的容量。这些功能取决于相邻两个星形胶质细胞通过GJ形成的功能合胞体,对谷氨酸、钾等起到“空间稀释”作用[5]。当受到外来侵犯时,受损细胞通过GJ将谷氨酸等有害物质释放到相邻细胞,起到了自我保护作用。

曾经认为HC的主要功能是形成GJ,后来发现了不形成GJ的功能性HC的存在。大量研究证实HC可将细胞内大量自分泌/旁分泌信号分子如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)、谷氨酸、前列腺素E2等释放到细胞外环境中。生理情况下,HC主要处于关闭状态,以形成GJ为主,另外也允许与细胞信号有关的分子释放,如传播细胞间Ca2+波动所必需的ATP和NAD+[6]。病理情况下,如脑缺血、炎症、氧糖剥夺、细胞外低钙时,HC开放,导致静息膜电位的紊乱、ATP和谷氨酸毒性物质的释放、大量摄取水分导致细胞水肿和破裂[4,7]。在一些细胞类型(如星形胶质细胞、心肌细胞、肾小管)中,Cx43HC活性增加可加剧细胞死亡,表明它可以决定细胞损伤的传播[8]。目前普遍认为,病理情况下HC的开放能加重神经损伤。

Cx43与神经炎症神经炎症是脑损伤及许多急性、慢行退行性疾病的共同过程。这个过程的主要特征是反应性星形胶质细胞和小胶质细胞激活,而小胶质细胞的激活导致大量炎性因子的释放,如IL-1β和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)[6,8-9]。星形胶质细胞中含量最多的Cx是Cx43。近年来,越来越多的研究表明神经炎症引起Cx43表达和GJ及HC通讯的改变,从而影响神经功能。

神经炎症抑制Cx43GJ通讯 细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是小胶质细胞的刺激器,被广泛应用于构建神经炎症模型。2006年,Meme等[9]发现LPS激活的小胶质细胞可以抑制星形胶质细胞GJ通讯,并表明小胶质细胞激活释放的炎性因子IL-1β和TNF-α在该过程中起关键作用。后来证实LPS激活的小胶质细胞或IL-1β和TNF-α均可以抑制星形胶质细胞GJ通讯,表现为划痕标记染料示踪技术中荧光黄的转移率明显降低[8,10-12]。以上星形胶质细胞系均来源于鼠类大脑皮层。随着研究的深入,在其他部位的星形胶质细胞系中也发现类似现象。如大鼠脊髓原代星形胶质细胞系,联合给予炎性因子TNF-α和干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)可抑制Cx43GJ通讯[13]。这种现象在体内实验中也得到证实。向大鼠脑室内慢性注射LPS,发现海马区Cx43GJ通讯减少[14]。最新一项研究表明小鼠肝炎病毒感染导致的急性神经炎症也伴随着Cx43GJ通讯减少[15]。神经炎症时Cx43GJ减少,使星形胶质细胞的“空间稀释”作用减弱,剥夺了对神经元的保护作用,加剧神经元死亡。

相关机制 有关神经炎症抑制Cx43GJ通讯的机制研究很多,但尚无统一定论,目前主要集中在促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路激活、Cx43磷酸化、Cx43合成改变等3个方面。c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)信号通路是MAPK信号通路的另一亚类,有研究发现在脊髓星形胶质细胞中,神经炎症时产生的炎性因子TNF-α和INF-γ通过激活JNK信号通路引起Cx43GJ抑制[13]。进一步研究发现,TNF-α和INF-γ通过激活泛素蛋白酶复合体系统,导致Cx43降解,进而抑制Cx43GJ通讯,并且激活的泛素蛋白酶复合体系统可被JNK抑制剂所阻断[16]。也有研究表明抑制p38MAPK信号通路可以阻断IL-1β和TNF-α导致的Cx43GJ减少[8]。Liao等[10]研究发现神经炎症导致的Cx43GJ通讯抑制是由caveolin-3基因的下调所介导。另外,Cx43磷酸化状态影响GJ通讯功能,但存在争议。有的认为Cx43丝氨酸368(serine368,s368)磷酸化导致GJ通讯功能降低[17],但有的认为Cx43去磷酸化与GJ通讯功能降低有关[18-19]。Cx43的合成状态也影响其GJ通讯,如小鼠肝炎病毒感染导致的急性神经炎症,伴随着星形胶质细胞Cx43表达的改变,大量Cx43停留在内质网或内质网高尔基复合体阶段,使Cx43GJ形成障碍,进而抑制Cx43GJ通讯[15]。总之,神经炎症抑制Cx43GJ通讯的机制尚未明了,仍处于探索阶段。

神经炎症增加Cx43HC活性 神经炎症时,星形胶质细胞Cx43GJ通讯被抑制,但Cx43HC活性增加。Retamal等[8]通过检测Cx43HC对溴化乙淀(EthBr,EB)的渗透率来反映HC活性,发现神经炎症时星形胶质细胞Cx43HC对EB的渗透率明显增加,并且同时给予IL-1β和TNF-α也可以明显增加Cx43HC活性,这说明小胶质细胞激活释放的炎性因子IL-1β和TNF-α在该过程中发挥重要作用。进一步研究发现,敲除Cx43转基因小鼠的星形胶质细胞系,给予激活的小胶质细胞或IL-1β和TNF-α刺激后,EB的渗透率没有增加,并且以上效应可被HC阻滞剂La3+明显抑制,更加说明神经炎症时星形胶质细胞Cx43HC活性增加[8]。同样,在小鼠大脑皮层星形胶质细胞系,Froger等[11]和Orellana等[12]也证实神经炎症可以明显增加Cx43HC活性。Abudara等[20]在急性海马切片中发现LPS刺激导致星形胶质细胞Cx43HC开放,且该过程需要小胶质细胞激活释放的炎性因子IL-1β和TNF-α的参与。近来一项最新研究发现经TNF-α处理的星形胶质细胞其活性明显增加,同时伴有Cx43HC活性增加[21]。脑缺血多伴有神经炎症的发生,在体内实验中,对足月生的绵羊行双侧颈动脉闭塞30 min来制造脑缺血模型,发现脑缺血后Cx43HC开放[22]。以上研究表明:在神经炎症状态下星形胶质细胞Cx43HC活性增加,而HC的开放影响神经胶质细胞的相互作用,使ATP、谷氨酸等大量毒性物质释放,促进损伤的扩散,加剧细胞死亡进而影响神经功能。

相关机制 神经炎症增加Cx43HC活性的机制复杂,目前尚未明确,研究表明与神经炎症时细胞外钙离子水平的改变、氧糖代谢紊乱、MAPK及N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)信号通路激活等有关。对细胞外低钙敏感的Cx43转染细胞出现Cx43HC的开放[23],因此人们猜想在神经炎症等病理情况下,细胞外钙离子的改变可能是促进HC开放的一个重要机制。近来一项以AD为模型的研究发现细胞外高钙导致Cx43HC的开放,首先他们验证了AD小鼠海马星形胶质细胞系细胞外静息钙离子水平增高,炎性反应扩大,Cx43HC活性增加,然后降低细胞外钙离子水平至基础水平以下,发现Cx43HC活性增加被明显抑制[24]。神经炎症多伴有氧糖代谢紊乱,Orellana等[26]在星形胶质细胞培养基中模拟缺氧环境,发现缺氧增加Cx43HC活性,并且该效应被细胞外高糖加剧,但是细胞外糖过低也增加Cx43HC活性,只是不如高糖明显[25]。另外,神经炎症导致的Cx43HC开放可被提前给予的p38MAPK抑制剂阻断[8,26]。Froger等[11]则发现IL-1β和TNF-α加剧了NMDA介导的神经毒性反应,且该过程与Cx43HC活性增加有关,因此猜测p38MAPK、NMDA信号通路的激活参与了该过程。目前针对该机制的研究比较局限,有待于进一步探索。

Cx43GJ及HC的改变影响神经预后神经炎症引起星形胶质细胞Cx43GJ抑制和HC活性增加,分别导致星形胶质细胞“空间稀释”作用减弱和大量谷氨酸、ATP等毒性物质的释放,引起神经元死亡[2,11-12],加剧了神经退变和认知损伤的进程。

神经退变 神经退变疾病的主要特征是神经元结构和功能进行性丧失,大量研究表明Cx43GJ和HC的改变推进了神经退变疾病进程[4,6,27-28]。Aβ肽形成是AD患者的典型特征,在Aβ肽处星形胶质细胞Cx43免疫活性增加[29]。同样在AD模型中,接触Aβ肽的海马切片小胶质细胞激活,炎性反应放大,Cx43HC激活[24],猜测Cx43HC的改变可能促进了损伤的传播。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)也是常见的神经退变疾病,PD患者伴有黑质胶质细胞激活,进而表达大量的促炎因子(如IL-1β、TNF-α、INF-γ)[27],这些炎症因子可能导致星形胶质细胞Cx43GJ和HC的改变。研究发现在PD动物模型中,总Cx43mRNA水平和星形胶质细胞Cx43免疫活性明显增加,而GJ通讯未发生改变[30],猜测是Cx43HC活性增加。另外,Cx43的改变也参与了多发性硬化[31]和亨廷顿病[32]的发展。总之,Cx43的改变推进了神经退变进程。

认知损伤 神经炎症引起Cx43GJ和HC的改变,近来研究发现这种变化与认知损伤有关。自闭症患者常伴有认知功能损伤,神经解剖学研究发现其大脑结构有许多畸形,其中额皮质畸形可能与认知损伤有关[33]。自闭症患者伴有神经炎症和小胶质细胞激活及促炎因子的增加,并且额上回区域Cx43表达量明显增加,表明Cx43的改变参与了认知损伤[34]。重度抑郁症(major depressive disorder,MDD)是最常见的精神病之一,多伴有严重的认知损伤,越来越多的研究证实MDD与星形胶质细胞Cx43GJ通讯功能异常有关。Ren等[35]表明MDD大鼠Cx43 GJ通讯功能减退。脑缺血、神经炎症时Cx43HC活性增加。Li等[36]研究发现给予Cx43HC特异性阻断剂Gap26可以改善大鼠的认知功能,水迷宫结果提示空间记忆能力和学习能力明显提高,说明神经炎症引起的Cx43HC活性增加导致认知损伤。由以上研究推测Cx43的改变加剧了认知功能损伤。

结语脑卒中、AD及术后认知功能障碍等CNS疾病的共同特征是神经炎症,大量研究证实神经炎症抑制Cx43GJ通讯、增加Cx43HC活性,分别导致星形胶质细胞“空间稀释”作用减弱和ATP、谷氨酸等毒性物质的释放,加剧了CNS疾病的进程。阐明Cx43与神经炎症的关系,有助于进一步探索Cx43对CNS疾病的影响。目前针对Cx43的阻滞剂被广泛研究,随着对Cx43的深入探讨,其有望成为延缓CNS疾病进展的新的靶点。