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心力衰竭(HF)是各种结构改变或功能减退的心脏疾病导致心室充盈及(或)射血能力受损而引起的一组复杂的临床综合征[1]。据统计，发达国家1%～2%的成年人患有HF，70岁以上的人群中HF发病率可高达10%[2]。大约有50%的HF病人在诊断后5年内死亡[3]，其中有50%的死亡原因是心源性猝死[4]。电生理重构导致的恶性心律失常是HF病人死亡的重要原因之一[5]。电生理重构是指在HF时，由于心肌细胞病理生理机制发生变化，而改变其电冲动的产生及传导[6]。目前，临床上仍缺少针对HF电生理重构的有效药物。中医认为，气虚血瘀水停是HF的基本病机，而气虚贯穿HF发展始终[7]，党参是临床防治HF常用的益气药。本实验通过使用党参干预压力负荷导致HF小鼠，观察党参对HF小鼠电生理重构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性C57BL/6J小鼠25 g±5 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2012- 0001，饲养于中国中医科学院中药研究所动物房，每天定时喂食、喂水并清洁动物房。

1.2 实验药物及配制溶液 中药党参颗粒制剂，购自北京中医药大学东方医院；酒石酸美托洛尔(倍他乐克)：阿斯利康制药有限公司，生产批号：1209047；水合氯酸为国产分析纯试剂；咖啡因；丁卡因；配制溶液：台氏液，KB液，消化液，0Ca/0Na台式液，30%丙烯酰胺溶液，4×分离胶缓冲液(1.5M Tris- HCl，pH 8.8，200 mL)，4×积层胶缓冲液(0.5M Tris- HCl，pH6.8，50 mL)，10%过硫酸铵，10×电泳缓冲液，染色液，脱色液，丽春红染液，10×PBS，转膜缓冲液，5%封闭液。

1.3 实验仪器 单细胞动缘探测系统(IonOptix，USA)，电子刺激器 SEN 27103 (IonOptix，USA)，小动物超声心动检测系统(Vevo770 ultrasound system，Visual Sonics Inc，USA)，心电检测平台ecgTUNNEL(EMKA Technologies，France)，Langendorff心脏灌流系统，微电极B15014F(微探科学仪器有限公司)等。

1.4 缩窄小鼠胸主动脉动物造模 对麻醉后的小鼠于胸骨正中线处剪开皮肤，切口(0.5～1) cm，钝性剥离肌肉。暴露主动脉弓胸主动脉分支处，将28- gauge注射器针头平行放置于胸主动脉上，用4号聚丙烯缝线将针头和主动脉结扎。假手术不结扎胸主动脉，其余步骤同模型组。

1.5 实验干预 将手术成功后存活的小鼠随机分为模型组、党参组、西药组，每组12只，常规喂养3 d后灌胃给药。各组灌胃总量均为20 ml/kg，共灌胃4周。假手术组和模型组给予生理盐水灌胃；党参组给予党参6 g/(kg·d)灌胃；西药组给予酒石酸美托洛尔10 mg(kg·d)灌胃。

1.6 超声心动检测小鼠收缩和舒张功能 测量左室射血分数(LVEF)、左室短轴收缩率(LVFS)，评价心脏收缩功能；测量舒张早期二尖瓣口血流速度(E)和舒张早期室间隔运动速度(Ea)，并计算E/Ea，评价心脏舒张功能。各参数连续测量3个心动周期，计算平均值。

1.7 心电图检测 使用ecgTUNNEL心电检测平台，检测清醒状态下6导联体表心电图。每只小鼠在记录前适应5 min后开始记录20 min，使用IOX软件(EMKA Technologies，France)记录。使用ECGAuto软件(EMKA Technologies，France)进行分析，按参考文献[8]设定心电图分析模板，分析QT间期以及校正QT间期(corrected Q- T interval，QTc)。

1.8 钙瞬变 心室肌细胞急性分离，各组小鼠在干预4周检测心功能后，取出一段带有主动脉的心脏，通过Langendorff装置上消化，最后使细胞保存在正常的含钙台式液(1.2 mmol/L Ca2+)备用。 钙漏和钙库的检测，选取横纹清晰、收缩稳定、边界清楚的长杆状细胞，利用IonOptix单细胞动缘检测系统测定细胞功能。检测心肌细胞肌浆网钙漏、钙库。

1.9 全细胞膜片钳技术 细胞稳定10 min后，给予1.5倍阈上刺激的电流(时程3 ms～5 ms)以诱发动作电位，刺激频率为0.2 Hz或2.0 Hz，记录动作电位，分析动作电位复极90%时间(APD90)。

1.10 Western Blot检测 运用Western Blot检测干预后各组SERCA、PLB、CAMK蛋白水平及活性。对总蛋白进行提取、浓度测定、制备相应浓度的分离胶及浓缩胶，并进行分离与浓缩，在浓缩胶聚合的过程中，将样品与适量蛋白上样缓冲液充分混匀，加热使蛋白变性，待浓缩胶聚合完全，把凝胶固定于垂直电泳装置上，槽内加入甘氨酸电泳缓冲液，将变性后的蛋白样品和预染蛋白Marker小心地加入上样槽进行电泳，调整电压，电泳直至溴酚蓝至分离胶底部时停止，凝胶用适量转膜缓冲液平衡后即可进行转膜，免疫反应后进行ECL显影，使用软件进行蛋白印迹分析，检测相应蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 小鼠存活情况 术后4周模型组小鼠死亡3只，假手术组无小鼠死亡，党参组小鼠死亡3只，西药组小鼠死亡5只。

2.2 小鼠心脏功能 与假手术组相比，模型组LVEF、FS显著降低，E/Ea显著升高(P<0.01)，表明压力负荷增加导致小鼠HF。与模型组相比，党参组LVEF、FS显著提高(P<0.01)，表明党参可改善HF小鼠心脏收缩功能，而西药对心功能舒缩功能改善均不明显。详见表1。左室短轴切面和M型超声详见图1。

表1 党参对HF小鼠左室功能的影响(±s)

图1左室短轴切面和M型超声

2.3 电生理重构

2.3.1 QT间期、校正QT间期 与假手术组相比，模型组QT间期、QTc均显著延长(P<0.01)，表明压力负荷导致了小鼠电生理重构。与模型组相比，党参组小鼠QTc缩短(P<0.01)，说明党参可改善电生理重构，而西药组心电参数改善不明显。详见表2。

表2 党参对HF小鼠QT间期、QTc的影响(±s)

2.3.2 细胞动作电位复极90%时间(APD90) 模型组与假手术组相比，在0.2 Hz、2.0 Hz频率刺激下心肌细胞APD90均显著延长(P<0.01)；党参组与模型组相比，在0.2 Hz、2.0 Hz频率刺激下心肌细胞APD90显著缩短(P<0.01)；西药组与模型组相比，APD90无统计学意义。提示党参可改善电生理重构，而西药组无明显改善作用。详见表3。

表3 党参对HF小鼠0.2 Hz、2.0 Hz频率刺激下心肌细胞APD90的影响(±s) ms

2.4 钙漏和钙库 与假手术组相比，模型组钙渗漏显著增加(P<0.01)，基线水平和钙库容量差异无统计学意义。与模型组相比，党参组钙漏减小(P<0.05)，说明党参可抑制肌浆网钙漏，而西药组对肌浆网钙漏的无明显抑制作用。详见表4。钙漏和钙库的测量详见图2。

表4 党参对HF小鼠心肌细胞钙漏和钙库的影响(±s)

图2钙漏和钙库的测量

2.5 钙循环相关蛋白表达含量 与假手术相比，模型组SERCA、PLB及其比值无明显变化，而CAMK表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，党参组CAMK表达含量降低(P<0.05)。详见表5、图3～图5。

表5 钙循环相关蛋白表达含量(±s)

图3 SERCA表达含量

图4 PLB表达含量

图5 CAMKⅡ表达含量

3 讨 论

近几十年中医在HF辨证防治方面做了大量的研究工作，现较为统一完整的认识是，HF病机概括为本虚标实，即在气虚、阳虚之人体正虚的基础上存在血瘀、水饮、痰饮等实邪。郭维琴指出气虚血瘀是HF最根本的病机，亦体现本虚标实是HF之根本，气虚血瘀和阳虚水泛为基本病机[9]。邓铁涛认为[10]，就HF病机而言，依然可以认为是经典的本虚标实，本为心之阳气亏虚或兼以心阴亏虚，标为瘀血兼以水停。陈可冀用“虚”“瘀”“水”三个字高度概括HF发生发展的病机[11]。林谦等[12]研究提示HF在发生发展变化过程中最常见的证候是气虚血瘀水停，并在中医气血理论基础的指导下，结合自身临床经验，首创了具有针对性的“益气活血利水”方，对于改善病人临床症状、提高生活质量、改善心功能等多方面疗效显著。

党参作为补益药物最早见于清朝吴仪洛《本草从新》[13]。现代研究表明党参中富含皂苷和微量生物碱等多种化学成分，具有补中益气等功效[14]。王硕仁等[15]研究发现服用党参提取液可明显提高左室舒张期E波峰值和左房室间压力阶差，显著缩短左室舒张早期充盈时间，明显增加左室收缩功能的心输出量；同时，党参可明显提高小白鼠心肌糖原、琥珀酸脱氢酶的含量，成为党参改善心肌能量代谢、补气强心作用的机制之一。

电生理重构导致的恶性心律失常是HF病人死亡的重要原因之一，严重影响HF病人的预后[16]。电生理重构在HF时，病理生理机制变化，导致心肌细胞的电活动发生异常，其最重要的表现为获得性QT间期、APD延长，这与心肌细胞除极、复极速度不同步有关[17]。本实验研究结果表明，在缩窄胸主动脉4周后，小鼠LVEF、LVFS均下降，说明压力负荷致HF造模成功；QT间期、APD延长，出现了电生理重构。党参组可缩短QTc和APD90，疗效优于西药(倍他乐克)组，说明党参对电生理重构有一定改善作用。

在兴奋- 收缩耦联过程中，钙库内钙离子经肌浆网上雷尼丁受体(RyR2)释放入细胞质中，与横桥结合，细胞收缩；舒张期时由肌浆网上钙转运蛋白(SERCA2a)及其调节蛋白受磷蛋白(phospholamban，PLB)将钙离子运回钙库内[18]。在HF心肌细胞中，RyR2稳定性降低，舒张期钙通道异常开放，在舒张期发生钙离子的释放，形成产生钙渗漏[19- 20]。舒张期钙离子的异常释放，能激活Na/Ca通道，影响心肌细胞的复极，引发后除极。在某些严重的情况下，可诱发严重的恶性室性心律失常，最终导致心源性猝死[21- 22]。而本实验中，党参可明显抑制钙漏，可能与抑制CAMKⅡ表达有关，而倍他乐克无此效果。细胞质内钙离子含量及钙库含量无明显变化，可能与SERCA2a、PLB功能不受影响有关。

本实验研究表明，党参可改善压力负荷导致HF小鼠电生理重构，可能与通过抑制CAMKⅡ表达，抑制肌浆网钙漏有关。

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