刘玉含 闫 琛 康运凯 魏 攀

(郑州人民医院检验科，河南 郑州 450003)

食管癌主要类型为食管鳞状上皮细胞癌，约占90%。食管癌发生涉及多个原癌基因、抑癌基因及其相关蛋白质的改变〔1〕。Notch-1是Notch信号通路中4个Notch同源体之一，在细胞分化、发育、增殖和凋亡过程中起重要作用，在甲状腺癌等一些恶性肿瘤中呈现抑癌基因表达〔2〕。TMEM16A是TMEM16膜蛋白家族成员之一，是钙激活依赖性的氯离子通道分子基础，在结肠癌等一些恶性肿瘤中异常高表达〔3〕。本文旨在探讨Notch-1和TMEM16A蛋白在食管鳞癌发病机制中的作用及二者的相关性。

1 材料和方法

1.1材料 2012～2013年郑州人民医院存档的手术切除食管鳞癌标本共55例，术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。其中男35例，女20例；年龄<60岁为13例，≥60岁为42例。取距病变组织5 cm以上的食管正常组织55例为正常对照组。标本均经10%甲醛溶液固定过夜，次日取材、脱水、石蜡包埋，连续切片，行HE染色及免疫组化染色。

1.2主要试剂 兔抗人TMEM16A多克隆抗体购自英国Abcam公司，羊抗人Notch-1多克隆抗体、免疫组化S-P试剂盒和DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3方法 采用免疫组化法对Notch-1和TMEM16A进行染色，操作步骤按照试剂说明书进行。用0.01 mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)替代一抗为阴性对照。以英国Abcam公司提供的阳性切片为阳性对照。Notch-1主要表达于细胞质中，以细胞质内出现棕黄色或黄褐色颗粒判读为阳性细胞；TMEM16A表达于细胞膜上和细胞质中，以细胞膜上或细胞质内出现棕黄色或黄褐色颗粒判读为阳性细胞。

1.4评价标准 观察并记录组织切片中的两项指标，染色阳性细胞占细胞总数的百分率和阳性细胞着色程度，综合评估试验结果。组织切片中阳性细胞占细胞总数的百分比可分为4级：阳性细胞<10%，0分；10%～25%，1分；26%～50%，2分；>50%，3分。组织切片中细胞染色强度分为3级：未着色，0分；淡黄色，1分；棕褐色2分。2项指标的结果相乘得到0分为(-)，≥1分为(+)。染色结果及评分由2位经验丰富的病理科医生独立操作进行。

1.5统计学分析 采用SPSS13.0软件进行χ2检验、Spearman相关分析。

2 结 果

2.1Notch-1和TMEM16A在正常食管和食管鳞癌中的表达 正常对照组和食管鳞癌组Notch-1、TMEM16A阳性率分别为96.36%(53/55)、14.55%(8/55)；47.27%(26/55)、55.36%(31/55)；二者比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2Notch-1和TMEM16A表达与食管鳞癌患者临床病理特征的关系 二者蛋白表达均与食管鳞癌分化程度和淋巴结转移有关；Notch-1蛋白表达还与TNM分期、浸润深度有关(P<0.05)。见表1。

2.3食管鳞癌组织中Notch1和TMEM16A蛋白表达的相关性 Notch1与TMEM16A阳性表达呈明显负相关(r=-0.497，P=0.001)。

表1 食管鳞癌组织中Notch-1和TMEM16A阳性表达在不同临床病理特征中的关系(%)

3 讨 论

Notch基因最早是在果蝇中被发现，Notch信号通路是一种保守的信号转导通路，在多种组织及器官的早期发育过程中，可调节多种细胞的生长、发育、增殖和凋亡〔4〕。目前已发现的人Notch信号受体有4种(Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4)，其中最主要的为Notch-1，Notch-1信号激活可抑制血管内皮细胞萌芽及血管管腔扩大，从而抑制血管新生；信号阻断可诱发血管内皮细胞增生〔5〕。除了调控血管内皮细胞的增生和凋亡外，Notch-1信号异常表达还可诱导肿瘤。目前在人类的许多恶性肿瘤中均发现Notch-1受体的异常表达，但在不同组织的肿瘤及肿瘤发展的不同阶段，Notch-1的作用可能不同：在结肠癌〔6〕中，Notch-1呈高表达状态，可促进肿瘤生成，起癌基因作用，在肺癌〔7〕中，Notch-1呈低表达状态，起抑癌基因作用。

本实验结果提示Notch-1可能在食管鳞癌发病机制中起抑癌基因的作用。Notch-1有望成为食管鳞癌早期诊断和评估预后的辅助指标之一。

钙激活氯离子通道(CaCCs)是一类离子通道蛋白，广泛分布于人体的多种组织，尤其是分泌器官上皮细胞，如气管和消化道黏膜上皮〔8〕，在多种生理功能中发挥重要作用，TMEM16A是CaCCs的分子基础〔9〕。TMEM16A基因定位于人染色体11q13区域上，含有26个外显子，其编码的TMEM16A蛋白含有986个氨基酸，相对分子量为114 000 kD。研究发现TMEM16A高表达于结肠癌〔10〕、眼睑基底细胞癌〔11〕和胃腺癌〔12〕等多种恶性肿瘤组织中。

本实验结果提示TMEM16A可能与食管鳞癌的发生、发展相关。TMEM16A的高表达对判断食管鳞癌患者的肿瘤分化程度有重要的参考价值，TMEM16A可作为评价肿瘤预后的标准之一。

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5林念慈，孙绍裘，李益亮.Notch信号通路配体对血管新生的影响〔J〕.中医正骨，2015；27(5)：70-2.

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8付兆君，刘红巾，程 军，等.人血管内皮细胞特异性表达TMEM16B〔J〕.空军医学杂志，2015；31(3)：151-7.

9郝 峰，白雪松，鞠晓红，等.TMEM16A钙激活氯离子通道在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞的表达及其电生理特性研究〔J〕.中国病理生理杂志，2014；30(9)：1633-9.

10陈 曦，孙海斌.组织蛋白酶D、Tmem16a和乳腺肿瘤激酶在结肠癌中的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(7)：1984-5.

11马浏莉.眼睑基底细胞癌术后组织中ILK、Tmem16a与Ki67表达的关系及意义〔J〕.青海医学院学报，2014；35(4)：272-5.

12杨 军，刘 妮，康安静，等.TMEM16A在胃腺癌中的表达及意义〔J〕.南方医科大学学报，2012；32(6)：794-7.