肖 斌 张春燕 罗国松 赵晓芳 余文静 成 鹰 段春燕 王进举 冯春红 夏先明 代荣阳

(西南医科大学生物化学与分子生物学教研室，四川 泸州 646000)

细胞接触抑制是正常细胞生长的关键特性〔1，2〕。然而，癌细胞通常丧失接触抑制，使之能够无限制增殖〔3〕。原癌基因c-Myc在多种组织细胞中广泛表达，对细胞生长和增殖起重要调节作用〔4〕。据统计，c-Myc在几乎近一半的人类肿瘤中表达失调〔5～7〕。胆管癌(CCA)恶性程度极高，预后较差〔8〕。研究显示c-Myc在CCA中具有重要调控作用，在胆汁淤积性肝损伤和CCA形成过程中可诱导c-Myc表达，并且c-Myc基因敲除后能抑制CCA的进展〔9〕。已有研究指出雷帕霉素靶蛋白(mTOR)参与调节细胞接触抑制，且mTOR信号通路在CCA细胞的生长和存活中发挥重要作用〔10〕。YAP参与调控细胞接触抑制、肿瘤发生等过程，Merlin是YAP上游的关键抑制分子〔11〕。本实验旨在探讨c-Myc在CCA细胞抵抗接触抑制中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1材料 c-Myc抑制剂10058-F4(F4)和YAP抑制剂verteporfin(VP)购自Selleck Chemicals公司；mTOR抑制剂rapamycin购自Tocris Bioscience公司；抗细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p27、c-Myc、p-p70S6K、p70S6K、p-S6、p-YAP(ser127)、YAP、p-Merlin和Merlin一抗均购自Cell Signaling Technology公司；抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗、人c-Myc siRNA和对照siRNA购自Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理 人正常胆管上皮细胞HIBEC、CCA细胞QBC939和RBE用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基培养于5% CO2，37℃孵箱内培养。细胞以不同的密度铺板，细胞实现低密度(约50%汇合度)和高密度(100%汇合度)。

1.2.2Western印迹分析 十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质后，采用半干式电转移将蛋白分子转移到硝酸纤维素(NC)膜，电转移结束后NC膜用Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次(5 min/次)，封阻缓冲液(5% BSA)在室温下密闭轻摇动封阻1 h。TBST洗涤3次(5 min/次)后，NC膜与一抗稀释液室温下轻摇动孵育2 h，TBST洗涤3次(5 min/次)。NC膜与荧光二抗稀释液于室温下轻摇动孵育1 h，TBST洗涤3次(5 min/次)。Odyssey扫描显色。

1.2.3流式细胞术 将细胞固定过夜，重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)中，并在暗盒中用碘化丙啶(PI)染色30 min。在Becton-Dickinson FAC Scan流式细胞仪系统上测量DNA含量。

1.2.4RNA干扰 细胞接种于35 mm皿，将10 μl浓度为20 μmol/L的siRNA储存液与100 μl DMEM混合，同时将8 μl Lipofectamine 2000与100 μl DMEM混合，然后将两种溶液混匀并加入正常培养的细胞中。培养6 h后更换新鲜的完全培养基。

1.3统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1低、高密度培养时HIBEC、QBC939和RBE细胞周期分布情况 如图1流式细胞术结果显示，高密度培养的HIBEC细胞出现接触抑制，其细胞周期停滞在G0/G1期，而QBC939和RBE细胞在高密度时仍有较强的增殖能力(图1A)。Western印迹结果显示，高密度培养的HIBEC细胞中CyclinD1蛋白水平比低密度时显著下调，而p27蛋白表达上调。高密度培养的QBC939和RBE细胞中CyclinD1持续高表达且未见p27表达明显诱导(图1B)。

图1 CCA细胞抵抗接触抑制

2.2Western印迹检测HIBEC、QBC939和RBE细胞在低、高密度时c-Myc的蛋白水平 与低密度相比，高密度培养的HIBEC细胞中c-Myc蛋白明显下降(P<0.05)，而QBC939和RBE细胞在低、高密度培养时c-Myc蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹结果表明，10058-F4处理显著下调QBC939和RBE细胞中c-Myc的蛋白表达，同时抑制CyclinD1表达。流式细胞术结果证实10058-F4可诱导高密度的QBC939和RBE细胞周期停滞在G0/G1期。见图2，图3。

2.3c-Myc通过mTOR信号通路促进人QBC939抵抗接触抑制 在HIBEC细胞中，p70S6K和S6的磷酸化水平在高密度时受到显著抑制，而在QBC939和RBE细胞中无显著变化(图4A)。采用c-Myc抑制剂10058-F4处理高密度QBC939和RBE细胞后，p70S6K和S6的磷酸化水平明显减弱(图4B)。siRNA干扰c-Myc表达结果显示干扰c-Myc不仅能够下调磷酸化p70S6K和S6，还显著抑制了CyclinD1的表达(图4C)。rapamycin处理的高密度QBC939和RBE细胞周期停滞在G0/G1期。见图5。

图2 c-Myc在高密度胆管癌细胞中的表达及其对CyclinD1表达的影响

图3 c-Myc调控CCA细胞抵抗接触抑制

图4 c-Myc通过mTOR信号通路促进CCA细胞抵抗接触抑制

图5 抑制mTOR恢复CCA细胞接触抑制

2.4YAP调控c-Myc在高密度CCA细胞中的异常高表达 在高密度HIBEC细胞中，YAP磷酸化水平显著上调，而在高密度QBC939和RBE细胞中无显著改变(图6A)。Western印迹分析提示，在高密度QBC939和RBE细胞用verteporfin抑制YAP活性不仅下调了c-Myc蛋白水平，还抑制了CyclinD1表达(图6B)。

免疫印迹结果提示，在HIBEC细胞中，Merlin磷酸化在高密度时受到抑制，表明Merlin活性上调，而在高密度QBC939和RBE细胞中Merlin磷酸化水平反而上调，说明Merlin活性受到抑制(图6C)。

图6 Merlin/YAP调控c-Myc介导的CCA细胞抵抗接触抑制

3 讨 论

接触抑制是指正常细胞在生长培养过程中，当细胞相互接触汇合时，细胞的增殖能力受到抑制，出现生长停滞。接触抑制的丢失是大多数肿瘤细胞的一大标志〔3〕，失去接触抑制调控的肿瘤细胞获得了无限增殖的潜能。本实验结果显示，正常胆管上皮细胞在高密度时出现接触抑制现象，而CCA细胞抵抗接触抑制。有许多信号分子参与调控细胞接触抑制的发生〔11〕，但肿瘤细胞抵抗接触抑制的具体机制仍有待阐明。

研究证实，c-Myc调控CCA的发生发展〔12〕，而c-Myc在胆管癌进展中的具体分子机制仍不清楚。本研究显示c-Myc在增殖状态下的正常胆管上皮细胞中高表达，而在细胞发生接触抑制时受到显著抑制。c-Myc在高低密度不同培养状态下的人CCA细胞中始终保持高水平表达，因而推测c-Myc可能参与调控CCA细胞接触抑制的丢失。此假设在后续实验得到了证实，抑制c-Myc活性或干扰c-Myc表达均可恢复CCA细胞的接触抑制。这表明c-Myc能够通过促进CCA细胞逃避细胞接触抑制促进CCA的进程。

mTOR是哺乳动物组织和细胞中广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛参与正常细胞代谢、细胞运动、细胞存活和血管生成等过程〔13〕。mTOR信号通路在肿瘤细胞中通常呈过度激活状态，与肿瘤细胞的增生、分化、凋亡、转移和侵袭有关，在许多恶性肿瘤中起重要作用〔14〕。研究表明，mTOR信号失活是细胞接触抑制的重要分子事件〔10〕。本实验发现在发生接触抑制的正常胆管上皮细胞中mTOR活性受到显著抑制。研究表明，mTOR信号通路参与CCA的发生发展，并且抑制mTOR后能抑制CCA细胞增殖〔10〕，但mTOR是否参与调控CCA细胞接触抑制未见报道。本研究结果发现mTOR在CCA细胞低、高密度中均保持高度活化状态，而rapamycin抑制mTOR后使得CCA细胞恢复接触抑制，并且10058-F4抑制c-Myc后显著降低了高密度CCA细胞中mTOR的活性。这些结果表明c-Myc可通过mTOR促进胆管癌细胞接触抑制。

本实验发现，在发生接触抑制的正常胆管上皮细胞中YAP活性受到抑制，而在高密度培养的胆管癌细胞中YAP仍保持高活性水平。抑制YAP活性显著降低高密度培养的胆管癌细胞中c-Myc和CyclinD1表达，表明c-Myc在高密度胆管癌细胞中的表达失调受YAP信号调控。此外，本研究结果提示，YAP/c-Myc在高密度胆管癌细胞中的失调与肿瘤抑制蛋白Merlin功能失调紧密相关。Merlin/YAP/c-Myc/mTOR信号在CCA细胞逃避接触抑制中的重要作用，对该通路在CCA抵抗接触抑制中的进一步研究不仅有助于胆管癌分子机制的阐明，也可能为CCA的防治提供新思路。

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