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重组人生长激素对癫痫持续状态大鼠神经元凋亡及XIAP、Caspase-3表达的影响

2012-09-13郝庆伟郑辑英李光来薛国芳

中西医结合心脑血管病杂志 2012年2期
关键词:胞浆阳性细胞海马

郝庆伟,郑辑英,李光来,薛国芳,耿 瑜

癫痫持续状态(SE)是常见的临床急症,是细胞层面的自身失控性发作。国际癫痫组织定义为癫痫连续发作之间意识未完全恢复又频繁再发,或发作持续30min以上不自行停止。癫痫连续发作30min后,海马神经元开始死亡[1]。细胞凋亡是SE后脑神经元死亡的形式之一,在SE后脑神经元死亡过程中扮演重要角色。近年来,一些研究表明,生长激素(GH)能改善大脑缺血缺氧引起的损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞存活等作用[2,3]。本实验通过应用重组人生长激素(rhGH)观察大鼠SE后大鼠脑组织凋亡相关基因XIAP、Caspase-3的表达情况,探讨rhGH干预对SE导致的神经元损伤的影响及其可能机制,以期为rhGH应用于临床SE的治疗提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年雄性 Wistar大鼠54只,鼠龄3个月~4个月,体重180g~240g,山西医科大实验动物中心提供。重组人生长激素注射液由长春金赛药业有限责任公司生产;匹罗卡品购自美国Sigma公司;兔抗鼠XIAP多克隆抗体、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体、TUNEL试剂盒、即用型SABC试剂盒均系武汉博士德公司提供;氯化锂购自中国医药集团上海试剂公司;DAB试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司出品;余均为市售分析纯品。

1.2 动物分组及模型的建立 选用健康成年雄性Wistar大鼠54只,随机分为对照组6只,模型组、rhGH组各24只。模型组、rhGH组再分为4个亚组,每个亚组6只,分别对应癫痫持续状态后6h、12h、24h和48h四个时间点。rhGH组颈部皮下注射重组人生长激素0.1U/(kg·d),对照组、模型组颈部皮下注射等容积生理盐水。持续一周,1次/24h。注射5d后,除对照组外,其余各组均腹腔注射氯化锂127mg/kg,18h后再腹腔注射新鲜配制的毛果芸香碱(匹罗卡品)30mg/kg,对照组给予等容积生理盐水腹腔注射。观察大鼠出现癫痫发作的时间和行为表现,痫性发作持续超过30min为SE。在SE达1h时,腹腔注射地西泮10mg/kg,终止痫性发作。在癫痫持续状态后6h、12h、24h和48h分别断头取脑,对大鼠海马组织进行研究,进行各指标的检测。惊厥评分采用Racine评分法,出现3级以上发作提示造模成功,造模过程中大鼠出现死亡或不符合模型要求者,予以剔除并随机补充,以保证每组动物6只。

1.3 标本处理 各相应时间点大鼠用25%乌拉坦4mL/kg深麻醉后,断头取脑,大鼠脑组织置入4%多聚甲醛中固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋后,在视交叉后海马区连续冠状切片,片厚5μm,每隔15张连续取4张,相邻切片分为四套,分别进行各指标的检测。HE染色,光镜下观察形态学变化。

1.4 细胞凋亡检测 采用TUNEL法检测,按试剂盒提供的方法进行操作,细胞核中有棕黄色颗粒者即为阳性细胞,即凋亡细胞。

1.5 XIAP、Caspase-3检测 采用SABC法(链霉亲和素-生物素过氧化酶连接法)免疫组化步骤按照试剂盒推荐方法进行(常规SABC法,DAB染色)。胞浆或核膜染色呈棕黄色为蛋白阳性表达。

1.6 结果处理 每张切片取5个视野,在BI-2000图像分析系统下用400倍显微镜下分别测定每个视野XIAP、Caspase-3、TUNEL阳性细胞个数,然后计算平均阳性细胞数。胞浆或核膜内染色呈棕黄色为XIAP蛋白阳性表达;胞浆或胞核内有棕黄色沉淀物为Caspase-3蛋白阳性表达;细胞核中有棕黄色颗粒者即为TUNEL阳性细胞。

2 结 果

2.1 发作行为观察 正常对照组均未出现癫痫发作。模型组和rhGH组大鼠在给予匹罗卡品后10min~30min均出现竖毛,流涎,节律性点头,洗脸样动作等面部痉挛样动作,接着出现单侧或双侧前肢阵挛、站立,进一步发展为全身强直-阵挛发作,双侧后肢强直,身体背屈,跌倒,反复发作,达到癫痫持续状态。

2.2 XIAP蛋白的表达 XIAP阳性细胞主要分布在海马CA1区和CA3区,其阳性细胞染色主要为胞浆、突起及核膜中呈棕黄色。对照组XIAP阳性细胞仅有微量的基础表达。与对照组相比,模型组6h时XIAP表达开始增强(P<0.05),12h时XIAP的表达达到高峰(P<0.05),24h时XIAP的表达开始减弱(P<0.05),48h时XIAP的表达明显减弱(P<0.05)。rhGH组与模型组相比,SE后各个时间点(除6h外)XIAP蛋白的表达均显著高于模型组(P<0.05),表现为胞浆及核膜染色,呈棕黄色,胞浆内有棕黄色颗粒聚集。详见表1。

表1 各组大鼠海马XIAP阳性细胞数比较(±s)

表1 各组大鼠海马XIAP阳性细胞数比较(±s)

组别6h 12h 24h 48h对照组12.71±1.66模型组 27.35±1.991) 42.05±2.191) 36.17±2.111) 25.43±1.381)rhGH组 32.24±1.251) 55.90±2.371)2) 44.32±1.221)2) 36.92±2.011)2)与对照组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05

2.3 Caspase-3蛋白的表达 Caspase-3阳性细胞主要分布在海马CA1区和CA3区,其阳性细胞染色主要表现为胞浆或胞核内有棕黄色沉淀物。正常对照组可见大鼠海马内少量的弱染色的、散在的Caspase-3阳性细胞。与对照组相比,模型组6 h时可见海马区内阳性细胞数开始增多;12h时可见较多细胞的胞浆和核内出现棕黄色沉淀物;随时间点延长而表达增加,24 h时阳性细胞及染色深度达高峰;48h时减少。rhGH组与模型组相比,6h时阳性细胞数差异无统计学意义;12h时可见较多阳性细胞,染色较深;Caspase-3阳性细胞仍在24h达高峰,但相应时间点Caspase-3阳性细胞的表达较模型组轻微,各时间点Caspase-3表达差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠海马Caspase-3阳性细胞数比较(±s)

表2 各组大鼠海马Caspase-3阳性细胞数比较(±s)

组别6h 48h对照组2.34±1.13模型组 13.15±1.831) 26.44±1.091)rhGH组 11.36±2.181) 14.05±1.271)2) 23.05±2.541)2) 17.37±2.171)2)与对照组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05

2.4 细胞凋亡检测 TUNEL阳性细胞要分布在海马CA1区和CA3区,其阳性细胞核染色呈棕黄色。对照组仅有少量的、散在的TUNEL阳性细胞表达,着色较浅。模型组6h时TUNEL阳性细胞表达开始增多,并随时间点的延长阳性细胞表达增加,24h达高峰,48h减少。与模型组相比,rhGH组TUNEL阳性细胞数仍在24h达高峰,但相应时间点TUNEL阳性细胞的表达均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠海马TUNEL阳性细胞数比较(±s)

表3 各组大鼠海马TUNEL阳性细胞数比较(±s)

组别6h 12h 24h 48h对照组3.15±0.67模型组 16.43±1.321) 31.33±2.061) 42.96±1.221) 28.95±2.031)rhGH组 13.86±1.311) 19.15±1.221)2) 31.07±1.241)2) 19.86±1.131)2)与对照组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05

3 讨 论

在大脑癫痫持续状态损伤过程中,有大量神经元凋亡。细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡,是正常细胞在受到生理性和病理性刺激后,出现的一种自发性死亡过程。细胞凋亡现已成为国内外研究的热点,在已取得许多非常有价值的成果中,Caspase的蛋白酶在细胞凋亡过程中起了重要的作用,通过特异性地裂解底物而发挥其执行细胞凋亡的作用。目前,人体内发现的IAPs有8个,其中XIAP是唯一可与凋亡启动因子Caspase-9及效应因子Caspase-3、Caspase-7相结合的凋亡抑制蛋白。

GH是由垂体前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化蛋白。其主要功能包括促进机体生长,减少蛋白质消耗,同时,GH与神经内分泌及免疫系统有着密切的联系。GH可以通过抑制酪氨酸磷酸化与干扰素所启动的信号转导途径而下调诱生型一氧化氮合酶的产生,进而减少细胞毒作用,甚至还可以抑制脂多糖诱导单核细胞所产生的肿瘤坏死因子,从而减轻炎症反应,而这对减轻大脑癫痫持续状态损伤后减少神经元的凋亡有一定的益处。但其具体机制尚不清楚,有待进一步研究,但这有可能为临床治疗癫痫持续状态提供一个新的思路和方法。

[1]Edward MM.Status epilepticus:Current treatment strategies[J].The Neurohospitalist,2011(1):23-31.

[2]Azcoitia I,Perez-Martin M,Salazar V,etal.Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampus[J].Neurobiol Aging,2005,26(5):697-703.

[3]Shin DH,Lee E,Kim JW,etal.Protective effect of growth hormone on neuronal apoptosis after hypoxia-ischemia in the neonatal rat brain[J].Neuroscience Letters,2004,354(1):64-68.

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