王 睿 金明顺 徐天娇 何 宁 朱 玉 王 伟

(齐齐哈尔医学院医药科学研究院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

抑郁症逐渐成为继心、脑血管疾病后第二位全球性精神系统疾病。抑郁症发病具有明显性别差异，女性抑郁症发病率约是男性2倍〔1〕。女性情感行为受激素水平影响，在激素变化的特殊时间点，如经前期、妊娠期、产褥期及围绝经期易发抑郁〔2〕。围绝经期是女性生殖系统由旺盛走向衰老的重要时期，是女性抑郁症高发时期，约有46%女性在围绝经期患有抑郁症〔3〕。雌激素(E)水平低下及外界环境刺激被认为是围绝经期抑郁症发病内、外两个因素。本研究观察外源性补充E对OVX后抑郁症动物模型小鼠行为学影响并探讨其神经生化机制。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 戊酸雌二醇(拜耳医药保健公司广州分公司，批号258A2)，小鼠5-羟色胺(HT)试剂盒(北京诚林生物技术有限公司分装，批号20131201)、小鼠去甲肾上腺素(NE)试剂盒、多巴胺(DA)试剂盒(北京诚林生物技术有限公司分装，批号20131215)，其他试剂均为国产分析醇试剂。

1.2主要仪器 旷场反应箱(自制)，强迫游泳水缸(自制)，DT1001电子天平(常熟市意欧仪器仪表有限公司)，5026型酶联免疫检测仪(奥地利TECAN公司)，MR1812型台式高速低温离心机(法国JOUAN公司)，PUEELAB PLUS超纯水系统(美国波尔公司)，全自动酶标仪(成都贝斯达仪器有限公司)等。

1.3动物 清洁级雌性昆明小鼠，体质量(20±2)g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，生产许可证号〔SCXK(黑)2013-0004〕。

1.4动物分组、模型制备及给药 旷场实验(OFT)筛选评分相近、体重均匀小鼠50只，适应性饲养1 w。饲养条件为，5只/笼，室温(22±1)℃，湿度(50±10)%，自然光照(12 L/12 D)，自由摄食饮水。随机分为5组，即假手术组(Sham)、OVX组、CUMS组、OVX+CUMS组及E治疗组(OVX+CUMS +E)，每组10只。采用OVX法制备E低下动物模型，其中Sham组、CUMS组仅剪去卵巢旁一小团脂肪组织，大小同OVX组。小鼠OVX后，常规饲养1 w。1 w后，采用CUMS法制备抑郁症小鼠模型，方法为禁食、禁水(24 h)、昼夜颠倒(12 D/12 L)、冰水游泳(5 min)、45℃环境热烘(5 min)、夹尾(1 min)、潮湿垫料、电击足底等7种刺激，这7种刺激每天随机采取一种，每天刺激都不规律，共计21 d。E治疗组(0.15 mg/kg)于每日应激前1 h灌胃给药，其余各组给予等体积的生理盐水灌胃，每日每次0.2 ml。

1.5阴道上皮角化实验 小鼠OVX后，7 d内连续监测各实验组阴道上皮脱落细胞相，以证明动物去势是否成功。

1.6动物一般体征 每天于应激前观察各组一般体征，观察并记录其自由活动及探索行为。

1.7体质量测试(BWM) 在实验第1、21天分别进行小鼠体质量测定。

1.8OFT 制备小鼠旷场反应箱(40 cm×40 cm×38 cm)，内壁涂黑，底面平均划分25个小格。选取安静场地，将小鼠放入反应箱中央，摄像系统记录动物在旷场内6 min的行为学表现，计算水平运动(3或4只脚同在一个格内计1分，穿越1格计1分，沿线行走每8 cm计1分)及垂直运动得分(记录小鼠站立次数；双前足离地1次为1分)。两只动物之间用75%酒精擦拭底部及四壁，以免“前任者效应”。实验在应激第1、21天各测定1次。

1.9强迫游泳实验(FST) 将小鼠单独置于水深15 cm的玻璃缸内(高20 cm，直径 14 cm)，水温(25±1)℃，游泳6 min，观察记录后4 min内小鼠在水中累计不动时间。每只小鼠实验结束后冲洗水缸、换水，避免对下一只测试小鼠产生影响。实验在应激第1、21天各测定1次。

1.10脑组织单胺类递质5-HT、NE、DA含量测定 小鼠造模结束后第2天，断头取脑，冰台上迅速取小鼠脑组织，称取脑组织重量。匀浆，4℃ 3 000 r/min离心20 min，静止，吸取上清，-80℃保存。按照试剂盒说明书测定单胺类神经递质5-HT、NE及DA含量。

1.11统计学分析 应用SPSS19.0软件进行one-way ANOVA，LSD检验。

2 结 果

2.1阴道上皮角化实验 与Sham组及CUMS组比较，OVX组阴道脱落细胞呈现大量白细胞和少量上皮细胞，7 d内连续监测，无周期性阴道细胞变化，角化细胞百分率(0.10±0.05)%，证明小鼠去势成功。见图1。

图1 各组阴道脱落细胞相(HE，×400)

2.2动物一般体征 应激第1天，各组皮肤光泽，常梳理毛发，对周围环境嗅查寻觅，自主活动及探索活动正常。应激第21天，与Sham组比较，OVX组、CUMS组自主活动及探索活动减少，理毛次数减少；与CUMS组比较，OVX+CUMS组毛色灰暗、粗糙、常倦怠不动；给予E治疗后，可改善小鼠一般体征，表现为皮肤光泽度较好，梳理毛发，有自主活动及探索活动。

2.3BWM 造模第1天，各组体质量差异无统计学意义(P>0.05)。造模第21天，与Sham组比较，CUMS组体质量下降、OVX组体质量明显增加(雌激素低下使动物体质量增加)(P<0.01)；与CUMS组比较，OVX+CUMS组体质量明显下降(P<0.01)；与OVX+CUMS组比较，E治疗组体质量明显增加(P<0.05)。见表1。

2.4OFT 造模第1天，各组OFT水平及垂直运动得分无显著差异(P>0.05)。造模第21天，与Sham组比较，CUMS组、OVX组OFT水平及垂直运动得分明显减少(P<0.01)；与CUMS组比较，OVX+CUMS组OFT水平及垂直运动得分明显下降(P<0.01)；与OVX+CUMS组比较，E治疗组OFT水平及垂直运动得分显著增加(P<0.01或P<0.05)。见表1。

2.5FST 造模第1天，各组FST不动时间差异无统计学意义(P>0.05)。造模第21天，与Sham组比较，CUMS组、OVX组FST不动时间显著增加(P<0.01)；与CUMS组比较，OVX+CUMS组FST不动时间显著增加(P<0.01)；与OVX+CUMS组比较，E治疗组FST不动时间显著减少(P<0.01)。见表1。

2.6脑组织单胺类递质5-HT、NE、DA含量测定 与Sham组比较，CUMS组、OVX组脑组织5-HT、NE及DA含量明显减少(P<0.01)。与CUMS组比较，OVX+CUMS组脑组织5-HT、NE及DA含量明显减少(P<0.01)。与OVX+CUMS组比较，E治疗组脑组织5-HT、NE及DA含量明显增加(P<0.01)。见表2。

表1 各组体质量、OFT水平及垂直运动得分、FST不动时间比较

与Sham组比较：1)P<0.01；与CUMS组比较：2)P<0.01；与OVX+ CUMS组比较：3)P<0.01，4)P<0.05；下表同

表2 各组脑组织5-HT、DA含量

3 讨 论

女性体内E含量变化与抑郁症发病程度相关〔1〕，性激素、与性别有关的基因在抑郁症的发病机制中具有重要作用〔2〕。因此，应激、激素、中枢神经递质与中枢神经系统相互作用与关系，在女性情感性精神疾病发生、发展中具有重要作用。

单胺类递质主要包括儿茶酚胺类(NE、DA及肾上腺素)及吲哚类(HT)两类。两类神经元分别以酪氨酸、色氨酸为底物，经过系列酶与底物羟化脱羧反应后形成，并储存于突触前膜囊泡内，依靠其转运体重摄取或被酶清除以维持体内动态平衡〔4〕。在阐明有关抑郁症发病机制及临床抗抑郁药物治疗中，“单胺类递质缺乏”学说认为，中枢神经系统中5-HT、NE及DA含量不足是引发抑郁症的主要原因。

E是一组甾体类激素，为“天然神经保护因子”，是具有神经调节和神经保护作用的激素〔3〕。主要源于脊椎动物卵巢和肾上腺皮质，给药后生物利用度97%～99%，半衰期13 h，经肝脏代谢，经尿排泄。E主要包括雌二醇(E2)、雌三醇(E3)及雌酮(E1)，以E2含量最多，生理效应最强。卵巢内膜细胞与颗粒细胞是E主要合成器官。脑是E作用的重要靶器官，E与其受体结合，通过基因组与非基因组机制对生殖、认知及情绪调节有关区域如皮质、海马有一定作用。E可作用中枢神经系统，调节中枢神经系统的结构和功能，调节情绪反应及认知功能。E对大脑神经细胞具有多靶向调节作用，可影响神经递质的合成、神经元生长、突触形成、神经元棘突密度和神经传导作用〔5〕，可调控星形胶质细胞和小胶质细胞生长〔6〕，可促进神经纤维形成并抑制神经细胞凋亡〔7〕。动物实验和临床实验均证明，女性抑郁与E撤退关系密切。E抗抑郁的潜在机制与调控单胺类神经递质含量及其受体表达〔8〕，通过非基因组机制调控脑源性生长因子(BDNF)、cAMP反应原件结合蛋白(CREB)等信号蛋白表达，促进海马神经发生密切相关〔9,10〕。

本研究结果表明，给予E治疗后，可改善抑郁模型小鼠行为学异常及增加脑组织单胺类递质5-HT、DA含量变化而具有抗抑郁作用，但具体抗抑郁有关信号通路机制仍需进一步探讨。

1Weber MT，Maki PM，McDermott MP.Cognition and mood in perimenopause:a systematic review and meta-analysis〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，2014;142(7):90-8.

2Karaoulanis SE，Rizouli KA，Rizoulis AA，etal.Lack of association of acute phase response proteins with hormone levels and antidepressant medication in perimenopausal depression〔J〕.BMC Psychiatry，2014;14(6):164-9.

3Borrow AP，Cameron NM.Estrogenic mediation of serotonergic and neurotrophic systems:implications for female mood disorders〔J〕.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2014;54(5):13-25.

4王晓滨.坤宁安对围绝经期慢性应激抑郁大鼠行为的影响及作用机制研究〔D〕.哈尔滨：黑龙江中医药大学，2010.

5Baudry M，Bi X，Aguirre C.Progesterone-estrogen interactions in synaptic plasticity and neuroprotection〔J〕.Neuroscience,2013;6(239):280-94.

6Johann S，Beyer C.Neuroprotection by gonadal steroid hormones in acute brain damage requires cooperation with astroglia and microglia〔J〕.Steroid Biochem Mol Biol,2013;137(9):71-81.

7Manthey D，Behl C.From structural biochemistry to expression profiling:neuroprotective activities of estrogen〔J〕.Neuroscience，2006;138(3):845-50.

8杨福中.雌二醇和氟西汀对抑郁症大鼠模型行为及5-HT递质系统的影响〔D〕.上海：复旦大学，2007.

9Yang LC，Zhang QG，Zhou CF，etal.Extra nuclear estrogen receptors mediate the neuroprotective effects of estrogen in the rat hippocampus〔J〕.PLoS One，2010;5(5):e9851

10Srivastava DP，Woolfrey KM，Evans PD.Mechanisms under lying the interactions between rapid estrogenic and BDNF control of synaptic connectivity〔J〕.Neuroscience，2013;239(6):17-33.