汪宁 王荣江 钟欢 汤建儿 陈煜 高建国

肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占全身恶性肿瘤的3%[1]。肾癌缺乏放化疗敏感性，治疗方式以根治性手术为主，如出现远处转移则延误最佳治疗时机[2]，因此寻找有效的肾癌标志物对指导疾病诊断、治疗及判断预后都具有重要的临床意义。动力蛋白轻链家族包括Tctex-1(Dynlt-1)、Dynlt-3、Dynll-1、Dynll-2、Dynrb-1、Dynrb-2。Tctex-1的编码基因位于6q25.2，分子量12 kDa，含有113AA，是由2个α螺旋和4个β链组成的二聚体。它主要富集在间质成纤维细胞的高尔基体上，同时在间期微管和核膜上也能检测到[3]。文献报道Tctex-1参与人乳头瘤病毒等感染从而影响宫颈癌的发生过程[4]，然而，Tctex-1与肾细胞癌的作用机制尚不明确。本研究通过沉默Tctex-1基因观察对肾癌786-O细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响，并探索其下游信号通路，为肾癌的治疗提供可能的靶点。

材料与方法

一、材料

Tctex-1、Wnt和VDAC1抗体购自英国Abcam公司；786-O细胞株购自中国科学院上海细胞库；脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自日本同仁化学株式会社；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。

二、体外化学合成小干扰RNA(siRNA)

应用Ambion公司提供的网上在线工具设计Tctex-1特异性的siRNA。序列：5′-TCAGATGGACAGTCCGAAGG-3′(反义)，5′-ATGCGTTAAAGATGGAAGACTTC-3′(正义)。

三、细胞转染与实验分组

常规消化收集细胞后，将细胞接种于6孔培养板。待细胞生长至密度为70%～80%时，按照LipofectamineTM2000说明书进行转染。实验分为Tctex-1-siRNA转染组及阴性对照组。

四、Western blot检测Tctex-1、Wnt和VDAC1蛋白表达水平

转染48 h后收集细胞，提取总蛋白，按每条泳道总蛋白30 μg加样，于SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL化学发光试剂(美国ProteinSimple公司)检测结果。……