任向峰， 姚 婷， 张 萌， 张 燕， 王友升

(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心， 北京 100048)

*王友升，男，教授，博士，主要从事果蔬绿色保鲜及其高值化方面的研究，通信作者。

链格孢属(AlternariaNees) 真菌作为果实采后常见的潜伏侵染病原菌，是半知菌暗色丝孢菌中重要的一类[1]，目前，全世界已经报道的链格孢属真菌约500种且仍不断发现新种[2-3]，仅在果蔬常见的就有互隔交链孢(A.alternata)[4]、细极链格孢菌(A.tenuissima)[5]、胡萝卜链格孢(A.dauci)[6]和葱链格孢(A.porri)[7]等，但对于属内种间的亲缘关系尤其碳源代谢指纹图谱的差异性，需要进一步理清。

利用不同物种间核糖体DNA的ITS区可能存在的碱基差异性，通过PCR扩增ITS区并进行同源性分析，可以对真菌进行鉴定[8-9]。Biolog 微生物自动分析系统可通过检测特定菌株对95种碳源的利用情况，获得该菌种的碳源代谢指纹图谱[10-12]。拮抗酵母菌的ITS区序列与碳源代谢指纹图谱可有效获取其生防能力的差异性基础[13]。将ITS区序列与碳源代谢指纹图谱表型特征相结合，对桃、李果实采后褐腐病菌的亲缘关系进行区分，且两种方法具有可比性[14]。前期的研究也表明，通过李果实采后病原菌串珠状赤霉(Gibberellamoniliformis)、链格孢菌(Alternariaalternata)、 草酸青霉(Penicilliumoxalicum)和塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)之间的ITS区序列与碳源代谢指纹图谱表型差异可推测出病原菌寄主特异性的物质基础[15]。

本研究分别从采后贮藏期发病的冬枣、樱桃、杏和蓝莓果实中分离得到4株病原真菌，通过形态学特征和rDNA ITS区序列分析进行鉴定，并对分子系统进化树和碳源指纹聚类分析结果进行比较，以期为不同果实采后病原菌的营养生理研究、病害防治及真菌种间关系研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1菌株

丝状病原真菌231#、320#、322#和333#分别从采后贮藏过程中自然发病的冬枣、樱桃、杏及蓝莓果实分离得到。

1.1.2培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)和麦芽浸粉培养基(malt extract agar，ME)按照参考文献[16]制备。

1.1.3试剂

DNA分子质量标准2×Taq PCR Master Mix，天根生化试剂公司；通用引物ITS-4和ITS-5，Invitrogen公司合成。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸钠(EDTA)、十二烷基磺酸钠(SDS) ，Amersco公司，乙醇、盐酸均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Imager 2200型凝胶成像系统，美国Alpha公司；MJX-250Ⅱ型霉菌培养箱，广东省医疗器械厂；Axio Image A1型显微镜，德国Zeiss公司；PCR仪，美国Bio-RAD公司；生物安全柜，美国Thermo公司；微生物鉴定系统，美国BIOLOG公司。

1.3 实验方法

1.3.1菌种的分离、纯化与回接

分离：取发病冬枣、樱桃、杏和蓝莓果实的病、健交界处组织于PDA上，25 ℃培养3 d。

纯化：从分离菌菌落的外沿取菌块，分别三点转接到PDA和ME上，25 ℃培养7 d，观察菌落形态和个体形态特征。

回接：挑选健康无损伤的冬枣、樱桃、杏和蓝莓果实，75%乙醇表面消毒，用无菌接种针刺孔，取纯化后的菌块接种至伤口处，观察果实接种处的病症。

1.3.2形态学观察

取纯化在PDA平板上的菌落外缘，分别采用三点接种法转接到PDA和ME平板上，25 ℃培养7 d和14 d后观察菌落形态。在洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，将插片培养的盖玻片置染色液中，盖上盖玻片，置于显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形状、色泽和分生孢子隔膜等性状。

1.3.3基因组DNA的提取及ITS区PCR扩增与序列测定

采用改良后SDS-氯化苄法[9]提取DNA。ITS-F(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS-R(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)为引物，PCR扩增ITS区，PCR产物由北京六合华大基因科技股份有限公司进行脱盐、纯化和双向测序，CExpress软件拼接，拼接序列在网站https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上进行核酸比对，在GeneBank数据库中找目的菌株同源序列，通过MEGA6软件进行同源性分析，构建进化树。

1.3.4碳源代谢指纹图谱分析

待测菌株在PDA培养基平板上26 ℃培养120 h后，用FF-IF浊度标准液制备T=(75±2)%的菌悬液，T为透光率。在FF微孔板中每孔加100 μL菌悬液，26 ℃培养7 d后，用Biolog微生物鉴定系统读取FF培养结果，获得病原菌的代谢指纹图谱[16]。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与回接

分别从自然发病的冬枣、“红灯”甜樱桃、黄杏和“蓝丰”蓝莓果实发病部位分离到丝状病原真菌231#、320#、322#和333#，见图1。其中，将分离得到菌株纯化后回接到冬枣(图1a)、“红灯”甜樱桃(图1b)、黄杏(图1c)、和“蓝丰”蓝莓(图1d)果实后，在接种部位均出现相同病症(图1e～h)，并能从该病害部位再次分离得到相应病原菌(结果未列出)，因此，可确定它们均为相应果实的病原菌。

2.2 病原菌的形态观察

2.2.1菌落形态

图1 4株病原真菌在不同果实上分离与回接时的病症Fig.1 Symptoms of isolated fruits and reinoculated fruits of four fungal pathogens

图2 4株病原菌在PDA和ME 25 ℃培养7 d的菌落特征Fig.2 Colony growth of four isolated strains cultured on ME and PDA plates for 7 d at 25 ℃

4株病原菌在PDA和ME培养基上25 ℃培养7 d后均生长旺盛，见图2，菌落边缘清晰、质地紧密、外观干燥而不透明。相比而言，菌株231#在PDA上菌落已长满平板呈灰褐色、轮纹不明显，而ME平板上菌丝灰白色、有轮纹(图2a,e)。菌株320#菌落整体呈灰绿色，PDA平板中央颜色较深(图2b,f)。菌株322#在PDA上菌丝白色中央呈褐色，而ME上菌落呈均匀白色(图2c,g)。菌株333#整体呈灰绿色，中央颜色较深，在ME上生长迅速，几乎长满平板(图2d,h)。

2.2.2显微形态

4株病原菌的个体形态基本一致，见图3，分生孢子呈倒棒状，顶端延长成喙状，淡褐色，有壁砖状分隔，暗褐色，成链生长，孢子的形态及大小基本一致(图3a～d)。菌丝着色较浅，分枝多且内部隔膜观察较为明显(图3e～h)。

将上述4株丝状真菌的菌落形态和显微形态的结果与《真菌鉴定手册》[17]对丝状真菌菌落、菌丝和孢子的描述进行比较，确定菌株231#、320#、322#和333#均为链格孢属真菌。

2.3 基因组DNA PCR扩增

以ITS-F和ITS-R为引物，4株病原菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到的产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测的结果见图4，可以看出，DNA片段大小约600 bp，片段长度存在一定的差异，可能由于rDNA ITS区存在长度和序列多态性[18]。

2.4 构建ITS区rDNA系统进化树

将4株病原真菌的rDNA ITS区序列在NCBI网站上比对，并且在GeneBank数据库中搜索同源序列，利用MEGA6软件构建的系统进化树如图5。可以看出，4株病原真菌中，菌株320#和322#在进化树中与A.alternata(AY625056.1)在同一分枝，置信度支持率达100%；而菌株231#与333#和A.tenuissima(KP324980.1)的亲缘性较近，置信度支持率为100%。

2.5 碳源代谢指纹图谱分析结果

4株链格孢菌的碳源代谢指纹图谱见表1。4株病原菌对95种碳源的代谢指纹图谱类似，它们共同的碳源代谢指纹图谱有86种，包括吐温80、N-乙酰-D-葡萄糖胺、核糖醇和苦杏仁苷等78种最适碳源，以及N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰基-β-D-甘露糖胺、L-海藻糖、葡萄糖醛酰胺、景天庚醛聚糖、N-乙酰-L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、2-氨基乙醇8种不可利用碳源，而对β-环式糊精、D-葡萄糖胺、肝糖、D-塔格糖、D-木糖、γ-羟丁酸、D-乳酸甲酯、腐胺、鸟苷则因株菌不同而存在显著差异。此外，菌株231#、320#、322#和333#与BIOLOG数据库中标准菌株A.alternata(Fr.) Keissl代谢能力相同的碳源均达到70种以上，其中231#与A.alternata(Fr.) Keissl的代谢指纹图谱最近，71种代谢相同的碳源包括核糖醇、苦杏仁苷和D-阿拉伯糖等65种最适碳源，以及N-乙酰-β-D-甘露糖胺、L-海藻糖和葡糖醛酰胺等6种不可利用碳源。

图3 4株病原菌的显微形态观察Fig.3 Morphological characteristics of four fungal pathogens

图4 4株病原真菌的ITS 区rDNA电泳检测图谱Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of ITS rDNA sequence of four strains

图5 4株以ITSr DNA基因序列为分子标记的链格孢菌菌株的系统进化树Fig.5 Position of four fungi strains based on ITS rDNA sequence in phylogenetic tree

以4株病原真菌(AlternariaNees)对95种碳源的利用作为聚类变量，采用比对法在MEGA6中构建碳源利用的系统进化树，结果如图6。可以看出，通过系统聚类分析可以清楚区分出4株病原真菌的碳源代谢特征，表明不同菌株之间在碳源代谢利用上的差异性，其中231#与A.alternaria(Fr.) Keissl的代谢指纹图谱最接近，而320#的代谢指纹图谱与A.alternaria(Fr.) Keissl的差异较大。

3 讨 论

本研究的结果表明，引起樱桃320#和杏322#黑腐病的病原菌为A.alternata，这与张娜等[19]、韩盛等[20]报道的相一致，该病原菌还可以引起苹果、台湾青枣、核桃黑斑病[21-23]。同时，我们发现枣231#为A.tenuissima，这与李静琴等[24]报道相一致，但目前对蓝莓黑腐病的链格孢菌只确定到属，而本研究将蓝莓333#确定为A.tenuissima。

表1 4株链格孢菌的碳源代谢指纹图谱

1)a表示最适碳源，b表示可利用碳源，c表示不可利用碳源；2)参考菌株为Alternariaalternata(Fr.) Keissl，其碳源代谢能力数值是指具有该代谢特征的菌株频率；3)待测菌株的碳源利用值是指该碳源所在孔与A1孔在750 nm处吸光度差值的1 600倍。

图6 4株链格孢属真菌碳源代谢指纹图谱的聚类分析Fig.6 Clustering drawing of four fungal pathogens by gresemblance of metabolic fingerprinting

不同桃、李果实采后褐腐病菌的rDNA ITS区序列亲缘性关系分析和碳源代谢指纹图谱分析结果表明，两种方法对5株桃、李果实采后褐腐病菌的分类结果一致，可以反映褐腐病菌种内亲缘关系，且两种方法具有可比性[14]。但本研究对4株链格孢菌ITS区序列的变异性分析发现，320#和322#与A.alternata(AY625056.1) 在同一分枝；枣231#与蓝莓333#和A.tenuissima(KP324980.1)的亲缘关系较近。然而，碳源代谢指纹图谱的结果表明，320#和333#在同一分枝上，与Biolog系统中的模式菌株A.alternata(Fr.) Keissl差异最大，231#与A.alternata(Fr.) Keissl对碳源的利用情况最相似，表明4株链格孢菌的ITS区序列系统进化树分类与碳源代谢聚类分析结果存在一定差异，即它们在ITS区碱基序列上的差异性与对95种碳源的利用差异性并不完全一致。这可能由于4株链格孢菌的碳源代谢除受自身遗传限制外，还受菌体自身生长状况等环境条件影响。

侵染性病害的发病过程常受到寄主自身营养条件的限制。本研究的碳源代谢图谱表明，4株菌可以利用的碳源都在88种以上，暗示链格孢菌对不同碳源的适应性较强，这可能是该属病原菌侵染范围广、难以进行有效生物防治的原因。因此，利用通过营养与空间竞争发挥生防效果的拮抗酵母菌来防治链格孢菌导致的病害，需进一步深入挖掘碳源代谢指纹图谱的特异性。

4 结 论

本研究分离到的4株病原真菌，确定均为链格孢属真菌(AlternariaNees)。碳源代谢指纹图谱分析表明，分离到的4株链格孢菌可利用碳源均达88种以上，对宿主碳源营养成分适应性很强，这应该是链格孢属真菌侵染范围广的原因。4株链格孢属真菌的ITS区序列分子鉴定分类与碳源代谢聚类结果存在一定差异。

[1] 闫璐, 高贵田, 哈益明, 等. 谷物中链格孢毒素的研究进展[J]. 核农学报, 2017, 31(2): 334-341.

YAN L,GAO G T,HA Y M,et al.Progress in the study of streftotoxin in grain[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2017, 31(2): 334-341.

[2] 王洪凯,张天宇,张猛. 链格孢属真菌分类研究进展[J].山东农业大学学报(自然科学版), 2001, 32(3):406-410.

WANG H K, ZHANG T Y, ZHANG M, et al.Advances on taxonomic studies of the genusAlternaria[J].Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science),2001, 32(3):406-410.

[3] 张天宇.中国真菌志：第十六卷链格孢属[M].北京:科学出版社, 2003:27-31.

[4] MALHADAS C, MALHEIRO R, PEREIRAR J A, et al. Antimicrobial activity of endophytic fungi from olive tree leaves[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2017, 33(3): 46.

[5] WEE J I, PARK J H, BACK C G, et al. First report of leaf spot caused byAlternariatenuissimaon black chokeberry (Aroniamelanocarpa) in Korea[J]. Mycobiology, 2016, 44(3): 187-190.

[6] BRUN S, MADRID H, VAN DEN ENDE B G, et al. Multilocus phylogeny and MALDI-TOF analysis of the plant pathogenic speciesAlternariadauciand relatives[J]. Fungal Biology, 2013, 117(1): 32-40.

[7] 王勇,周雪梅,盛洁,等. 洋葱紫斑病病原菌鉴定及生物学特性[J]. 北方园艺, 2016, 23:111-116.

WANG Y, ZHOU X M,SHENG J, et al.Pathogen identification and biological characteristics of onio violet leaf spot[J].Northern Horticulture,2016, 23:111-116.

[8] CAPPA F, COCCONCELLI P S. Identification of fungi from dairy products by means of 18S rRNA analysis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 69(1): 157-160.

[9] 王友升, 郭晓敏, 姚子鹏, 等. 1 株桃果实采后病原真菌的鉴定以及碳源代谢指纹图谱分析[J]. 北京工商大学学报(自然科学版), 2011, 29(1): 47-53.

WANG Y S, GUO X M, YAO Z P,et al.Identification and carbon metabolic fingerprinting analysis of a pathogen isolated from postharvest peach fruit[J].Journal of Beijing Technology and Business University( Natural Science Edition), 2011, 29(1): 47-53.

[10] SING M P. Application of biolog FF micro plate for substrate utilization and metabolite profiling of closely related fungi[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009, 77(1): 102-108.

[11] 王友升, 何欣萌, 张燕, 等. 1 株蒜薹采后病原真菌的鉴定, rDNA ITS序列及碳源代谢指纹图谱分析[J]. 食品科学, 2013, 34(15): 171-175.

WANG Y S, HE X M, ZHANG Y,et al.Identification, rDNA ITS analysis and carbon metabolic fingerprinting of a pathogenic fungus isolated from postharvest garlic sprout[J].Food Science, 2013, 34(15): 171-175.

[12] 王友升, 张燕, 何欣萌, 等. 1 株树莓果实采后病原真菌的rDNA ITS序列及碳源代谢指纹图谱分析[J]. 中国食品学报, 2015 (8): 224-230.

WANG Y S, ZHANG Y, HE X M,et al.Analysis of a fungi strain isolated from postharvest raspberry fruit based on rDNA ITS sequence and carbon metabolic fingerprinting[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2015(8): 224-230.

[13] 姚子鹏, 郭晓敏, 王友升, 等. 3 株罗伦隐球酵母的26S rDNA D1/D2区序列, 代谢指纹图谱及生防效力比较分析[J]. 食品科学, 2011, 32(1): 135-140.

YAO Z P,GUO X M,WANG Y S, et al.Comparative analyses of 26S rDNA D1/D2 sequence, metabolic fingerprint and bio-defense capability of three strains ofCryptococcuslaurentii[J].Food Science, 2011, 32(1): 135-140.

[14] 王友升, 张燕, 陈玉娟. 5 株桃, 李果实采后褐腐病菌鉴定, rDNA ITS 序列与碳源代谢指纹图谱分析[J]. 食品科学, 2012, 33(16): 246-250.

WANG Y S,ZHANG Y,CHEN Y J.Identification, rDNA ITS analysis and carbon metabolic fingerprinting of fiveMoniliniafructicolastrains isolated from postharvest peach and plum fruits[J].Food Science, 2012, 33(16): 246-250.

[15] 王友升, 陈玉娟, 张燕. 李果实贮藏期间4株病原真菌的分离, 鉴定及碳源代谢指纹图谱分析[J]. 食品科学, 2012, 33(13): 235-239.

WANG Y S,CHEN Y J,ZHANG Y. Isolation, identification and carbon metabolic fingerprinting analysis of four pathogens isolated from postharvest plum fruit[J].Food Science, 2012, 33(13): 235-239.

[16] 姚婷,陈其葳,张燕,等.3株果实采后葡萄孢属真菌ITS区rDNA序列与碳源代谢指纹图谱分析[J].食品科学技术学报,2017,35(4):49-55.

YAO T, CHEN Q W,ZHANG Y, et al. Analysis of rDNA ITS and carbon metabolic fingerprinting ofBotrytisnees isolated from three fruits[J].Journal of Food Science and Technology,2017,35(4):49-55.

[17] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海: 上海科技出版社, 1979:566-571.

[18] 燕勇,李卫平,高雯洁,等. rDNA-ITS序列分析在真菌鉴定中的应用[J]. 中国卫生检验杂志,18(10):1958-1961.

YAN Y,LI W P,GAO W J, et al. Application of rDNA-ITS sequence analysis in fungus identification[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,18(10):1958-1961.

[19] 张娜, 关文强, 阎瑞香, 等. 甜樱桃果实采后致病菌的分离及定性分析[J]. 中国农学通报, 2012, 28(13): 190-194.

ZHANG N, GUAN W Q, YAN R X, et al. Isolation and qualitative analysis of pathogenic bacteria for sweet cherry[J].Chinese Agricultural Science Bulletin, 2012, 28(13): 190-194.

[20] 韩盛, 玉山江, 麦麦提, 等. 鲜杏采后病原菌鉴定及室内药剂筛选研究[J]. 新疆农业科学, 2016, 53(5): 866-876.

HAN S,YU S J,MAI M T, et al. Identification of postharvest pathogens and screening of fungicides for fresh apricot in Xinjiang[J].Xinjiang Agricultural Sciences, 2016, 53(5): 866-876.

[21] ZHU L, NI W, LIU S, et al. Transcriptomics analysis of apple leaves in response toAlternariaalternataapple pathotype infection[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 22(8): 1-16.

[22] 赵丹丹, 王云, 付晓萍, 等. 台湾青枣致腐微生物的分离鉴定及其抑制研究[J]. 西南农业学报, 2016(2): 379-384.

ZHAO D D,WANG Y,FU X P, et al. Isolation, identification and inhibition of microorganisms causing mildew and rRot ofZizyphusmauritianalam[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences,2016(2): 379-384.

[23] 曲文文, 刘霞, 杨克强, 等. 山东省危害核桃的链格孢属真菌鉴定及其系统发育[J]. 植物保护学报, 2012, 39(2): 121-128.

QU W W, LIU X,YANG K Q, et al. Identification and phylogenetic analysis of walnut-associatedAlternariaspp. in Shandong Province,China[J].Acta Phytophylacica Sinica, 2012, 39(2): 121-128.

[24] 李静琴, 陈亮, 岳贵龙, 等. 冬枣储藏期致腐真菌分离鉴定及广谱拮抗菌株的筛选[J]. 河南工业大学学报(自然科学版), 2013, 34(2): 62-66.

LI J Q,CHEN L,YUE G L, et al. Isolation and identification of ROT-causing fungi of winter jujube in storage period and screening of broad spectrum antagonist[J].Journal of Henan University of Technology (Natural Science Edition), 2013, 34(2): 62-66.