谢军培 戴益琛 陈章兴 曾伟 詹晓娟 傅育卡 沈许德

(中国人民解放军第一七四医院消化内科,福建 厦门 361003)

大肠癌是临床常见恶性肿瘤之一，世界范围内其发病率居第3位。目前研究发现大部分大肠癌起源于大肠腺瘤，但对结肠腺瘤确切癌变途径和分子机制目前尚不清楚[1-3]。目前研究发现父系表达基因10(Paternally expressed gene 10, PEG10)在多种肿瘤中发挥重要作用，如前列腺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌，尤其亚细胞定位影响肿瘤生物学功能[4-7]。然而，关于PEG10蛋白与大肠癌生物学功能文献国内外报道尚少。本文旨在通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术引发的转录后基因沉默机制来研究PEG10对大肠癌细胞生物学行为的影响。本研究以结肠癌SW620细胞系为研究对象，探讨应用siRNA敲低结肠癌细胞中肿瘤特异性PEG10的表达，以期发现PEG10在大肠癌发生、发展中的作用机制以及它在调节大肠癌细胞生长及侵袭等生物学功能方面的作用，进而为PEG10能否成为是大肠癌早期诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 SW620大肠癌细胞株购买于ATCC(Ameriean type culture eolleetion)公司；空载体Pu6为本实验室保存；PEG10多克隆抗体购自美国Proteintech公司；C57BL/6小鼠购自中国上海动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SW620大肠癌细胞贴壁生长细胞，培养于含嘌呤霉素(浓度为100u/ml)的10%FBS的DMEM培养基，放置于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱，定期更换新鲜培养液。当细胞浓度约90%融合时即开始传代，弃去陈旧的培养基，再往培养基中加入0.25%胰蛋白酶，消化3分钟，弃去消化液，再次加入新培养基，反复吹打皿底上的细胞，使之形成均匀单细胞悬液，计数后立即移至新培养皿中进行传代培养。

1.2.2 构建PEG10干扰细胞株和过表达稳定细胞株 经序列同源性比对(BLAST)设计含siRNA靶序列的正、反义寡核苷酸。将所得到的靶序列按要求插入到相应位置，形成最终如下寡核苷酸链: Sense 5’-GCAGUCGGAGGAGAACAAC-3’, Antisense 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。转染前将大肠癌SW620细胞以合适的细胞密度接种在DMEM培养液的6孔板内, 在37℃培养箱进行恒温培养，确保细胞转染高效/稳定。待细胞浓度达到90%的融合, 按照siPEG10质粒∶脂质体比例为4 μg：10 μL加入质粒复合物及Lipofectamine 2000转染细胞，加入新鲜的培养液。实验设立siPEG10质粒组、pU6质粒对照组。用浓度为2.5μg/mL的嘌呤霉素培养基筛选，培养并转染对照组及重组质粒的细胞。待2周后筛选出PEG10干扰细胞株，分别提取细胞蛋白验证干扰效果。

1.2.3 PEG10蛋白的亚细胞定位 将SW620结肠癌细胞接种到培养皿中，用4%多聚甲醛固定10min。磷酸盐缓冲液(PBS)溶液冲洗3次。细胞采用0.2%Triton X-100透化处理10 min，用含2%牛血清白蛋白进行封闭30 min。PBS溶液冲洗3次。加入抗PEG10蛋白抗体，在温箱中放置l h。PBS溶液冲洗3次。加入荧光标记的二抗，室温孵育45 min。PBS溶液冲洗3次。加入0.5 mg/L的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液染色15 min。PBS溶液冲洗3次。最后加人20ul封片剂封片，-70℃冰箱中备用。激光扫描共聚焦显微镜成像拍照定位。

1.2.4 Western-blot蛋白检测 收集经过处理后的细胞，采用含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液反复裂解。BCA法进行定量蛋白质，取60ug蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，采用120V 恒压转移2h，室温内用2%BSA 封闭30min，待检测的一抗与NC膜室温孵育1h；PBST缓冲液反复洗膜3次，每次10min，将HRP标记的二抗加入，室温孵育30min。最后NC膜用ECL发光试剂盒处理，进行显影。

1.2.5 SW620细胞的侵袭能力 采用含有基质胶的Transwell小室进行研究，实验前在Transwell小室内外加入500ul无血清的DMEM，经常规消化后对细胞进行计数，用无血清培养基重悬细胞。每孔加入无血清的细胞悬液500ul,培养箱孵育22h后，反复用PBS冲洗，最后用甲醇固定，祛除上室底部膜上的细胞，反复采用PBS冲洗三遍，再加入0.1%结晶紫溶液200ul，37℃孵育30 min。最后拍照计数。

1.2.6 C57BL/6小鼠皮下成瘤生长情况 20只4-6个月大小的雄性C57BL/6小鼠，将其随机分为四组。在每只小鼠皮下分别注射5× 106细胞，7天后开始观察小鼠实体瘤和体重的变化增长情况。采用游标卡尺测量增长的肿瘤最大以及最小直径，小鼠的肿瘤体重和大小每隔2天进行测量。体积计算公式=[长(mm)×宽2]/2。第3周后，处死小鼠，取出瘤体进行拍照，根据测量数据绘制肿瘤增长曲线。

1.3 统计学分析 全部数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料均数±标准差表示，采用t检验对两组计量资料差异进行比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PEG10蛋白的亚细胞定位 激光扫描共聚焦显微镜成像表明，PEG10蛋白均定位在细胞质。PEG10在细胞内表达在共聚焦显微镜下，应用不同的抗体检测到的荧光信号基本一致。未经细胞膜预处理的SW620活细胞中均未检测到PEG10荧光信号，经0.2%Triton X-100 预处理组中细胞质上PEG10荧光信号明显强于细胞核中信号，见图1。

图1 PEG10在大肠癌细胞SW620的亚细胞定位(400×) Figure 1 Subcellular localization of PEG10 in colorectal cancer cells (400 x)

2.2 干扰质粒PU6-SiRNA-PEG10的鉴定 将阳性对照组为成功验证PEG10蛋白表达，实验组为在SW620细胞中提取蛋白。Western-blot结果显示：实验组显示一条特异性条带与对照的阳性条带大小一致(见图2)；利用Westen blot的方法检测稳转siRNA-PEG10-SW620细胞组、稳定转染pU6质粒的SW620细胞中PEG10蛋白表达水平，结果显示siRNA-PEG10细胞组在翻译水平的表达具有明显抑制效果，见图3。

图2 SW620细胞内源性PEG10表达的验证Figure 2 validation of endogenous PEG10 in SW620 cells

图3 Westen blot检验PEG10干扰蛋白表达Figure 3 Expression of siPEG10 by Westen blot

2.3 干扰PEG10对SW620细胞侵袭的影响 利用Transwell小室检测细胞侵袭能力，结果示稳转siRNA PEG10-SW620组有较少细胞穿越基质胶，而稳定转染对照质粒组有较多细胞穿过基质胶(见图4)。经统计学分析并比较实验组和对照组细胞的侵袭能力，差异有统计学意义(见图5)。光镜下拍照、计数、取均值，实验重复3次。本结果表明稳定转染干扰质粒组细胞较对照组细胞侵袭水平减弱，说明PEG10蛋白在增强SW620细胞侵袭力方面发挥重要作用。

图4 两组SW620细胞侵袭能力的比较Figure 4 Cell invasion ability of the two groups

图5 两组细胞侵袭能力统计比较Figure 5 Statistical comparison of invasion ability in the two groups

2.4 PEG10对裸鼠移植瘤生长的影响 皮下注射稳定的siPEG10-SW620和Pu6-SW620细胞(对照组)在C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型的建立，动态观察瘤体生长情况。注射细胞后1周，开始测量实验组及对照组裸鼠移植瘤的大小，每隔3天记录一次直到小鼠生长第24天。结果揭示：与对照组相比，实验组siPEG10-SW620细胞在裸鼠皮下移植瘤生长更缓慢，见图6。

图6 各组小鼠皮下瘤的生长情况比较Figure 6 Tumor growth of mice subcutaneous

3 讨论

随着我国经济发展和生活水平的日益提高，大肠癌早期筛查提示大肠癌的发病率呈逐年增长态势，2016年中国肿瘤年报统计发现城市地区大肠癌发病率占29.5/10万，占全部恶性肿瘤的12.81%，居第三位；死亡率为14.7/10万，居第四位[8-11]。国内外学者已证实大肠癌是恶性肿瘤致死的重要原因之一[12]。大肠癌发生、发展是多因素、多步骤的积累过程，确切发病机制目前尚不明确。大多患者就诊时已属中晚期，而化疗成为大肠癌的重要辅助治疗，在转移和预防其复发中发挥着不可替代的作用，而多数患者化疗药物治疗效果一般，其主要原因是大肠癌对多种化疗药存在广泛的耐药性，导致耐药现象的发生机制目前研究发现与多药耐药及相关基因异常表达有关[13-14]。因此寻找参与大肠癌侵袭、转移和化疗耐药的特异靶点并阐明其机制迫在眉睫。本实验研究确定了父系表达基因10(Paternally Expressed Gene 10，PEG10)在小鼠大肠癌细胞SW620的表达。2001年，日本科学家Ono等用cDNA 微阵列在肝癌细胞组织中发现一个父方表达的基因组印记基因(PEG10)，该基因定位于人类7 号染色体长臂2 号带1 号位( 7q21)[15-16]。目前研究发现PEG10基因可促进细胞的生长，也有研究发现这类基因的过表达或表达缺失可导致细胞的恶性转化[17-18]。将PEG10基因转染到不表达PEG10的肝癌细胞株，发现肝癌细胞生长明显加速，下调PEG10基因表达可抑制肝癌细胞的生长，表明PEG10基因具有促进肝癌细胞生长的作用[19-20]。

本研究通过采用RNAi技术沉默细胞系SW620中PEG10基因表达，与此同时观察PEG10基因在人大肠癌细胞系SW620细胞定位、对增殖、侵袭等过程中的作用。本实验发现改变PEG10基因表达可影响大肠癌细胞的侵袭和生长能力。Transwell分析结果也表明，与对照组相比，PEG10基因沉默后穿过Transwell小室的大肠癌细胞数减少，上述实验结果均显示PEG10基因对SW620大肠癌细胞迁移能力的影响；抑制SW620细胞中PEG10的表达，抑制细胞生长，为进一步验证实验结果可靠性，我们采用动物实验验证，研究显示与体外细胞研究结果一致，确定了PEG10基因在大肠癌中重要作用。然而，所涉及的分子机制方面还需进一步研究。目前研究发现ERK/MAPK信号通路的激活与大肠癌发生发展密切相关。虽然PEG10在癌症中的确切作用是未知的，这其中的细胞信号传导通路需要进一步研究。

本研究仍存在不足，PEG10 核聚集现象需要进一步的动态试验观察方可进一步得以证实。同时，在小部分大肠癌细胞中核聚集的PEG10的具体原因仍然不明，是否与凋亡状态有关，在将来，仍需要大量的实验进一步证实大肠癌细胞中的PEG10 的具体作用机制。本研究结果显示在结肠癌组织特异表达的遗传印记基因PEG10在大多数结肠癌组织中发生了印记丢失现象，PEG10的印记丢失可能是其在结肠癌组织中过表达的原因之一。结肠癌中PEGl0印记异常现象的发现为我们从表观遗传学角度探讨结肠癌发病机制提供了新的线索。加大样本量进一步证实本研究结果以及深入研究结肠癌中PEG10的印记调控机制将有助于我们进一步了解结肠癌的发病机制。

4 结 论

资料显示，父系表达基因10 ( Paternally Expressed Gene 10，PEG10)在体内外对小鼠大肠癌细胞SW620的侵袭和生长能力有促进作用，可为大肠癌早期诊断和治疗提供相关临床依据。

[1]Al-Asmari AK, Ullah Z, Al Balowi A,etal. In vitro determination of the efficacy of scorpion venoms as anti-cancer agents against colorectal cancer cells: a nano-liposomal delivery approach[J]. Int J Nanomedicine, 2017, 12: 559-574.

[2]Wang C, Jette N, Moussienko D,etal. ATM-Deficient Colorectal Cancer Cells Are Sensitive to the PARP Inhibitor Olaparib[J]. Transl Oncol, 2017, 10(2): 190-196.

[3]Zhu XS, Dai YC, Chen ZX,etal. Knockdown of ECHS1 protein expression inhibits hepatocellular carcinoma cell proliferation via suppression of Akt activity[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2013, 23(3): 275-82.

[4]何炜,王全玉,李晓敏,等.Notchl和c-Met在结直肠癌中的表达及其与血管生成拟态和预后的关系[J].西部医学,2016,28(9):1203-1206.

[5]Zhang J, He P, Zhong Q,etal. Increasing Cystatin C and Cathepsin B in Serum of Colorectal Cancer Patients[J]. Clin Lab, 2017, 63(2): 365-371.

[6]Kainz B, Shehata M, Bilban M,etal. Overexpression of the paternally expressed gene 10 (PEG10) from the imprinted locus on chromosome 7q21 in high-risk B-cell chronic lymphocytic leukemia[J]. Int J Cancer, 121(9): 1984-93.

[7]Zhang FW, Cheng HC, Jiang CD,etal. Imprinted status of pleomorphic adenoma gene-like I and paternal expression gene 10 genes in pigs[J]. J Anim Sci, 2007, 85(4): 886-90.

[8]朱小三,戴益琛,陈章兴,等.ECHS1经线粒体途径调控HepG2细胞凋亡[J].中国生物工程杂志,2013,22(8):10-14.

[9]Chen H, Sun M, Zhao G,etal. Elevated expression of PEG10 in human placentas from preeclamptic pregnancies[J]. Acta Histochem, 2012, 114(6):589-93.

[10] Wen J, Liu L, Song G,etal. Biallele expression of PEG10 gene in primordial germ cells derived from day 27 porcine fetuses[J]. Reprod Domest Anim, 2010, 45(6):e375-81.

[11] 朱小三,戴益琛,陈章兴,等.烯脂酰辅酶A水合酶短链1促进结肠癌HepG2细胞的增殖[J].肿瘤, 2013, 33(05): 422-427.

[12] 贾文斌,孙欣,杜志杰,等.青蒿琥酯对人结肠癌细胞HCT116和HT29的增殖与凋亡[J].中国医学创新, 2015, 12(12): 4-7.

[13] Hua Y, Ma X, Liu X,etal.Identification of the potential biomarkers for the metastasis of rectal adenocarcinoma[J]. APMIS, 2017, 125(2): 93-100.

[14] 龙庭凤,杨静,沈丽达,等.结肠癌组织中CIAPIN1 mRNA表达及意义[J].西部医学,2016,28(09):1243-1245.

[15] Ha GS, Kim YW, Choi EH,etal. Factors Associated with the Lack of Adjuvant Chemotherapy Following Curative Surgery for Stage II and III Colon Cancer: A Korean National Cohort Study[J]. Anticancer Res, 2017, 37(2): 915-922.

[16] Wu Y, Fang B, Yang XQ,etal. Therapeutic Molecular Targetingof 15-Lipoxygenase-1 in Colon Cancer[J]. Mol Ther,200,16(5):886-892.

[17] 朱小三,戴益琛.ECHS1的表达异常与临床的关系[J].医学分子生物学杂志, 2013,10(03):158-161.

[18] Xie JP, Zhu XS, Dai YC,etal. Expression of enoyl coenzyme A hydratase, short chain, 1 , in colorectal cancer and its association with clinic pathological characteristics[J]. Mol Clin Oncol, 2014, 2(1): 1081-1084.

[19] Chen H, Sun M, Liu J,etal. Silencing of Paternally Expressed Gene 10 Inhibits Trophoblast Proliferation and Invasion[J]. PLoS One, 2015, 10(12): 0144845.

[20] Agosto-Arroyo E, Isayeva T, Wei S,etal.Differential Gene Expression in Ductal Carcinoma In Situ of the Breast Based on ERBB2 Status[J]. Cancer Control, 2017, 24(1): 102-110.