刘思含，耿德勤，吴明凤，刘芷含

双环己酮草酰二腙(CPZ)诱导的脱髓鞘动物模型是CNS脱髓鞘疾病常见的研究模型之一。拉喹莫德(LAQ)是一种新型的免疫调节药物，近年来它被建议作为多发性硬化治疗的口服制剂。过去动物研究表明，它有抗炎、抑制抗原表达的基因等作用，但目前拉喹莫德作用机制尚未充分理解。研究[1-2]发现，拉喹莫德能减轻实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)及CPZ造模小鼠胼胝体区髓鞘脱失症状，但目前它保护神经功能的机制尚不清楚。本研究通过应用拉喹莫德，观察其对CPZ诱导的CNS脱髓鞘小鼠胼胝体区髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及其分泌的TNF-α和IL-1β表达的影响，以探讨LAQ对髓鞘保护的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 80只健康雄性C57BL/6小鼠，体质量23～25 g，由徐州医科大学实验动物中心提供。随机分为正常对照组(20只)、CPZ模型组(40只)及LAQ处理组(20只)。

1.1.2 主要试剂和仪器 CPZ(美国Sigma公司)；LAQ (ABR-215062)；羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)；鼠抗MBP(美国Abcam公司)；鸡抗GFAP(美国Abcam公司)；IL-1β 小鼠ELISA试剂盒(美国Abcam公司)；TNF alpha小鼠ELISA试剂盒(美国Abcam 公司)；冰冻切片机(德国Leica公司)；正置显微镜(日本Olympus BX60)。

1.2 方法

1.2.1 CPZ模型及药物干预方法 将CPZ掺入正常饲料组成0.3%的混合粉末。正常组给予正常饲料喂养，CPZ组给予喂养含有0.3% CPZ混合饲料，LAQ处理组喂食0.3% CPZ混合饲料同时给予LAQ灌胃(25 mg/kg)，每日1次，共8周。

1.2.2 MBP及GFAP免疫荧光检测 采用免疫荧光法检测脑组织MBP及GFAP阳性细胞分布。制备小鼠脱髓鞘后, 将CPZ组各时间点(0 d, 3 d, 7 d, 2周, 4周, 8周)小鼠(均随机取3只)经10%水合氯醛(1 ml/kg)腹腔注射麻醉，迅速开胸暴露心脏。经左心室快生理盐水冲洗，4 ℃多聚甲醛灌注、固定24 h。常规冰冻切片包埋剂(OCT)包埋后，在冰冻切片机上行连续冠状面切片(片厚20 μm)，选取小鼠前囟前后胼胝体部位，进行MBP和GFAP双重染色，并行DAPI荧光染色后置于正置显微镜下观察拍照。

1.2.3 MBP及GFAP蛋白水平的检测 采用免疫印迹法检测小鼠胼胝体区的MBP及GFAP蛋白的水平。每组于各时间点随机取3只小鼠，深麻醉后迅速处死，快速剥离脑组织，冰上操作去除皮质只保留胼胝体组织；取新鲜胼胝体组织300 mg。加入蛋白裂解液(RIPA裂解缓冲液)，匀浆，12 000 r/min离心30 min，分离上清。利用二辛可酸(BCA)法蛋白定量加入等体积的5×SDS buffer，99 ℃煮沸10 min变性，-80 ℃保存。总蛋白上样；经过SDS-聚乙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳、硝酸纤维素膜(NC)转膜、5%脱脂奶粉封闭，加入一抗或β-actin抗体4 ℃抗体过夜；洗膜后加入二抗，室温孵育2 h；洗膜，采用Odyssey 近红外双色激光成像系统拍照，利用Image J软件测定条带灰度值，计算MBP及GFAP蛋白条带总灰度与β-actin蛋白条带总灰度的比值作为MBP和GFAP蛋白相对水平。

1.2.4 TNF-α、IL-1β含量的检测 实验结束后取胼胝体，用冰生理盐水在冰浴下制成20%的混悬液。4 ℃ 4000 r/min 离心15 min，取上清液于-20 ℃冰箱待测。采用ELISA法检测受试小鼠各个时间点(0 d, 7 d, 2周, 4周, 8周)脑胼胝体中TNF-α、IL-1β蛋白含量，具体操作步骤严格按TNF-α、IL-1β定量ELISA说明书。

2 结 果

2.1 CPZ组小鼠脑组织胼胝体区MBP及GFAP染色情况 见图1。给予CPZ口服药物后立即处死小鼠观察发现胼胝体区MBP分布均匀，呈丝网状(图1A)；其中散在稀疏且形态纤细的GFAP阳性细胞(图1B)。造模3 d后，MBP阳性细胞分布较前减少(图1E)，GFAP细胞体增生，总体细胞形态稍肥大(图1F)。脱髓鞘7 d后，MBP阳性细胞分布减少(图1I)，GFAP数量显著增多，着色深，胞体肿胀，突起增多且长(图1J)；脱髓鞘2周后，MBP阳性细胞分布稀疏而短小(图1M)，GFAP阳性细胞胞体肿大，突起显著增长，分布密集(图1N)。脱髓鞘4周后，MBP阳性细胞着色浅，呈散在分布(图1Q)；GFAP阳性细胞密度增加、胞体肿胀且突起增多，病灶边缘处增生更明显(图1R)。脱髓鞘8周后MBP分布稍增多(图1U)，GFAP阳性细胞形态肥大、突起交错，已形成胶质瘢痕(图1V)。

2.2 各组小鼠脑组织胼胝体区MBP和GFAP蛋白的比较 见图2、表1。正常组小鼠各个时间点未有髓鞘碱性蛋白和胶质纤维酸性蛋白表达的显著改变。与CPZ组比较，LAQ组在4周、8周时MBP表达量增多(均P<0.05)；GFAP于7 d、2周、4周和8周表达量显著减少(均P<0.05)。

2.3 各组小鼠脑组织胼胝体区TNF-α及IL-1β含量的比较 见表2。CPZ组和LAQ组的两种炎症因子表达均高于正常组(均P<0.05)。与CPZ组相比，LAQ组TNF-α及IL-1β表达随着时间的增加而逐渐下降，于2周、4周和8周蛋白表达均有统计学意义(均P<0.05)。

图1CPZ组胼胝体区MBP和GFAP表达MBP阳性细胞表达为红色絮状物，GFAP阳性细胞表达为绿色条索样物，细胞核为蓝色颗粒；V图箭头指向CPZ组8周出现的胶质瘢痕(免疫荧光染色，×400)

图2 CPZ组和LAQ组各个时间点MBP及GFAP蛋白的表达。A：CPZ组；B：LAQ组

表2 各组小鼠各个时间点胼胝体区TNF⁃α及IL⁃1β表达的比较(x±s)组别指标(pg/ml)0d7d2周4周8周正常组msTNF⁃α97．52±18．2598．12±1．26101．20±19．31100．53±7．92105．83±7．20CPZ组msTNF⁃α100．32±19．29127．12±3．50142．30±12．64162．16±19．43187．39±20．11LAQ组msTNF⁃α93．19±18．23122．19±9．23#130．92±29．12∗#141．45±19．43∗#159．39±19．21∗#正常组msIL⁃1β93．74±20．4197．10±13．63#93．72±1．34#102．32±20．30#103．83±12．34#CPZ组msIL⁃1β94．28±27．52140．21±15．34#153．52±3．25#183．23±3．23#228．74±19．64#LAQ组msIL⁃1β93．02±21．95130．46±19．54#139．67±1．56∗#148．40±2．89∗#160．13±21．34∗# 注：与CPZ组比较∗P<005，与正常组相比较#P<005

3 讨 论

多发性硬化是一种CNS自身免疫系统疾病[3]。它的病理机制复杂，目前认为是髓鞘脱失、轴索变性、炎症浸润、胶质细胞增生填充组织缺损区域形成硬化斑有关[4]。近年来，星形胶质细胞在白质脱髓鞘的作用越来越受到重视。GFAP为星形胶质细胞的骨架和特异性标记物被广泛研究。曾有研究[5]发现，0.2% CPZ混合饲料喂食6周恢复正常饮食后，活化的星形胶质细胞可以减轻髓鞘脱失的损害。然而，另一些学者[6]认为慢性脱髓鞘疾病中活化的星形胶质细胞还可以激活核因子-kB通路，产生和释放TNF-α、IL-17等细胞炎性因子，最终生成神经毒性物质如一氧化氮，抑制了髓鞘的再生[7]。

本实验采用CPZ脱髓鞘动物模型后发现新型免疫调节剂LAQ对小鼠胼胝体区域少突胶质细胞的存活、星形胶质细胞的激活及其炎性因子的分泌存在一定的作用。以往实验采用EAE模型模拟CNS脱髓鞘的病理状态，但相比EAE模型，CPZ作为一种选择性铜离子螯合剂，可以稳定的诱导少突胶质细胞凋亡导致髓鞘的瓦解。因而，它更有利于开展脱髓鞘和髓鞘再生修复的研究[8-9]。本研究发现小鼠喂食CPZ混合饲料后胼胝体区MBP标记的少突胶质细胞数量逐渐减少，分布稀疏且松散，并于4周降至最低，8周时可见少许髓鞘再生；以上结果均表明了CPZ模型建立成功。然而随着脱髓鞘时间的延长，胼胝体区域星形胶质细胞逐渐增殖、活化，胞体肿胀，突起粗大、卷曲，填补缺损，且阳性细胞数量于4周时增至峰值，8周稍降低。随后本研究又采用了免疫印迹法分析各个时间点MBP及GFAP蛋白的动态水平，发现其变化趋势与免疫荧光结果一致。综上所述，本研究认为CPZ导致少突胶质细胞的损伤与星形胶质细胞的增殖、活化有关。

已有临床实验[10-11]证明，LAQ作为一种口服新型试验性免疫调节药物对复发缓解型多发性硬化(RRMS)有抗炎和神经保护性能。动物实验研究[12]显示它可以使Th1(T辅助Ⅰ细胞，产生促炎性细胞因子)向Th2(T辅助Ⅱ细胞，产生抗炎性细胞因子)的具有抗炎性特征的转化。另一实验[13]证明，EAE模型小鼠服用LAQ后脊髓损害部位脱髓鞘程度显著降低，从而保护了脊髓轴突和神经元的功能。然而，目前尚未有明确结论解释LAQ保护髓鞘的机制。本实验通过免疫印迹法研究发现LAQ治疗CPZ脱髓鞘小鼠后髓鞘标记物MBP蛋白表达量于4周、8周显著升高，而GFAP蛋白表达量于7 d、2周、4周及8周显著降低；提示了LAQ可能通过抑制了活化的星形胶质细胞参与了脱髓鞘模型后期髓鞘修复及再生的过程。

为了进一步探讨拉喹莫德保护髓鞘的机制，本研究在各个时间点(0 d，7 d，2周，4周，8周)采用ELISA技术检测激活的星形胶质细胞分泌的炎性因子IL-1β和TNF-α的动态改变。Sugama等[14]认为活化的星形胶质细胞大量释放IL-1β从而启动脑内免疫过程。解迪等[15]证明了脓毒症新生幼鼠脑胼胝体内的IL-1β与IL-1R1相互作用抑制ERK通道的激活导致少突胶质前体细胞分化成熟障碍，最终导致轴突低髓鞘化。TNF-α也是参与炎症反应的主要细胞之一[16]。动物实验[17]证实了TNF-α可通过少突胶质细胞的TNF/p55TNF信号通路导致少突胶质细胞的凋亡。以上均提示IL-1β和TNF-α可导致少突胶质细胞的损伤。本实验结果发现，LAQ组IL-1β和TNF-α表达逐渐降低，相比CPZ组于2周、4周、8周有显著性差异。

本实验证实，LAQ可以减轻CPZ介导的脱髓鞘模型小鼠胼胝体区少突胶质细胞的损伤，可能与抑制星形胶质细胞的活化及其分泌的炎症因子的表达有关；从而达到保护髓鞘和神经系统的功能。

[1] Wegner C, Stadelmann C, Pförtner R, et al. Laquinimod interferes with migratory capacity of T cells and reduces IL-17 levels, inflammatory demyelination and acute axonal damage in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol, 2010, 227: 133.

[2] Brück W, Pförtner R, Pham T, et al. Reduced astrocytic NF-κB activation by laquinimod protects from cuprizone-induced demyelination[J]. Acta Neuropathol, 2012, 124: 411.

[3] Sospedra M, Martin R. Immunology of multiple sclerosis[J]. Semin Neurol, 2016，36: 115.

[4] Popescu BF, Pirko I, Lucchinetti CF. Pathology of multiple sclerosis: where do we stand?[J]. Continuum (Minneap Minn), 2013, 19: 901.

[5] 宋大为，范凯，张艳丽，等．星形胶质细胞在cuprizone介导的急性脱髓动物模型中的变化及其意义[J]．中国临床解剖学杂志，2007，25：540.

[6] Raasch J, Zeller N, Van Loo G, et al. IkappaB kinase 2 determines oligodendrocyte loss by non-cell-autonomous activation of NF-kappaB in the central nervous system[J]. Brain, 2011, 134: 1184.

[7] Smith KJ, Kapoor R, Felts PA. Demyelination: the role of reactive Oxygen and Nitrogen species[J]. Brain Pathol, 1999, 9: 69.

[8] Matsushima GK, Morell P. The neurotoxicant, cuprizone,as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system[J]. Brain Pathol, 2001,11: 107.

[9] Ransohoff RM. Animal models of multiple sclerosis: the good, the bad and the Bottom line[J]. Nat Neurosci, 2012, 15: 1074.

[10] 周官恩，安中平．多发性硬化口服药物研究新进展[J]．中国现代神经疾病杂志，2012，12：147.

[11] Moore S, Khalaj AJ, Yoon J, et al. Therapeutic laquinimod treatment decreases inflammation, initiates axon remyelination, and improves motor deficit in a mouse model of multiple sclerosis[J]. Brain Behav, 2013, 3: 664.

[12] Brunmark C, Runström A, Ohlsson L, et al. The new orally active immunoregulator laquinimod (ABR-215062) effectively inhibits development and relapses of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol, 2002, 130: 163.

[13] Yang JS, Xu LY, Xiao BG, et al. Laquinimod (ABR-215062) suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis, modulates the Th1/Th2 balance and induces the Th3 cytokine TGF-beta in Lewis rats[J]. J Neuroimmunol, 2004, 156: 3.

[14] Sugama S, Takenouchi T, Sekiyama K, et al. Immunological responses of astroglia in the rat brain under acute stress: interleukin 1 beta co-localized in astroglia[J]. Neuroscience, 2011, 192: 429.

[15] 解迪，曾红科，陈纯波，等．IL-1β对脓毒症新生幼鼠胼胝体内少突胶质细胞前体细胞分化成熟的影响[J]．中国病理生理杂志，2015，31：385.

[16] Edwards MM, Robinson SR. TNF alpha affects the expression of GFAP and S100B: implications for Alzheimer’s disease[J]. J Neural Transm, 2006, 113: 1709.

[17] Akassoglou K, Bauer J, Kassiotis G, et al. Oligodendrocyte apoptosis and primary demyelination induced by local TNF/p55TNF receptor signaling in the central nervous system of transgenic mice: models for multiple sclerosis with primary oligodendrogliopathy[J]. Am J Pathol, 1998, 153: 801.