刘蓓 王芳 陈琳 余州 宋雅娟 王彤 苏映军

[摘要]目的：研究CD100分子在正常皮肤组织、急性创面及慢性创面中的表达。方法：采用免疫组化法检测外科手术切除的20例正常皮肤组织、30例急性创面及20例慢性创面边缘全层皮肤组织CD100的表达水平。结果：正常皮肤CD100主要表达于表皮，其中胞膜高表达，真皮不表達；急性创面中表皮CD100膜表达水平显著降低；慢性创面中CD100在表皮组织低表达而真皮表达显著升高。各组间表皮胞膜、胞质及真皮中CD100表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：在皮肤组织损伤早期，表皮组织膜型CD100的脱落可能对创面愈合早期发挥重要作用，慢性创面CD100表皮持续性低表达、真皮高表达的状态可能和创面难愈有关。

[关键词]创面愈合；CD100；免疫组织化学法；急性创面；慢性创面

[中图分类号]R64 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）10-0133-04

Abstract： Objective To investigate the expression of CD100 in normal skin tissue， acute wound and chronic wound tissues. Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD100 in 20 cases of normal skin tissues， 30 cases of acute wound and 20 cases of chronic wound tissues. Results The expression of CD100 in normal skin tissues was mainly expressed in the epidermis， and was not expressed in dermis. The expression level of membrane CD100 of epidermis in acute wound was significantly reduced. In the chronic wound， the expression level of CD100 in the epidermis was low， but the expression level in the dermis was increased significantly. The expression levels of CD100 in membrane and cytoplasm of epidermal and in dermis had statistical difference in the three groups （P<0.05）. Conclusion In the early skin tissue damage， shedding of membrane CD100 in epidermis may play an important role in acute wound healing. In chronic wounds， the condition of low CD100 expression in epidermis and the high CD100 expression in epidermis may be related to the difficulty of chronic wound healing.

Key words： wound healing； CD100； immunohistochemical method； acute wound； chronic wound

慢性难愈性创面，简称慢性创面，指临床治疗4～6周以上仍难以愈合或不愈合的创面。临床上常由糖尿病、静脉曲张、动脉硬化、动脉炎、神经系统疾病等所引起。在我国，伴随着人口逐步老龄化，糖尿病、下肢静脉溃疡、褥疮等疾病的发病率逐年上升，慢性创面的发生率越来越高，是目前外科临床工作中经常遇到的一个难题[1-2]。皮肤创伤愈合的病理生理过程非常复杂有序，涉及多种细胞、细胞外基质、生长因子和细胞因子的参与，构成复杂的调控网络，这些创面愈合的调控因素一旦表达异常或功能受损，就会造成创面不能按时相规律有序地进行组织学修复，从而引起创面经久不愈。因此，进一步阐明急、慢性创面愈合的分子机制对于慢性创面的治疗具有重要的意义。CD100（Semaphorin4D）属于脑信号蛋白（Semaphorin）家族中的一员，在神经系统和免疫系统中高表达[3]。CD100发挥多种生物学功能，包括神经细胞轴突导向、调节免疫反应、促进肿瘤细胞血管生成等[3-6]。体外实验和动物实验表明，CD100能够调节多种皮肤细胞功能，包括促进内皮细胞骨架重排、上皮细胞上皮化，树突状细胞的成熟等，CD100-/-小鼠较野生型小鼠相比创面愈合时间显著延迟。而截止目前，还未有CD100与人皮肤组织创面愈合关系的临床研究。在人皮肤组织创面愈合过程CD100的表达情况如何，在急性创面与慢性创面中CD100的表达格局是否有所差异，这种差异表达是否与创面难愈有关？为了回答上述问题，本研究选取临床急性创面、慢性创面及正常组织标本，用免疫组化染色的方法分析CD100分子在上述不同类型皮肤组织中的表达差异，为阐明CD100参与创面愈合过程的作用提供理论及实验依据。

1 材料和方法

1.1 临床组织标本

1.1.1 临床样本来源及一般资料：本实验所用标本均取自2015年7月-2017年7月就诊于西京医院整形外科门诊及住院患者外科手术切取的废弃组织。研究内容及研究方案获得西京医院伦理委员会的批准，并取得了患者或其监护人的知情同意书。

急性创面患者均为急诊外伤清创缝合的患者。排除标准：各种病因引起的慢性难愈性创面、严重感染创面、皮肤病及器质性病变患者。共30例，男16例，女14例；平均年龄23（7～51）岁；患处分别为头面部21例，肩部4例，下肢5例；致伤时间：1～9h，平均4h。

慢性创面患者：临床已确诊的全层皮肤组织缺失的慢性难愈性创面。排除标准：急性外伤患者、创面使用过生长因子药物治疗患者、皮肤病患者。共20例，男12例，女8例；平均年龄42（21～65）岁；分别为糖尿病足部溃疡6例，胸腹部、下肢感染性创面6例，严重外伤等组织缺损创面8例。

正常对照取自整形外科手术中切取的废弃皮肤组织，共20例，男11例，女9例；平均年龄23（1～55）岁；取样部位为头面部9例，四肢11例。

1.1.2 样本的取材：所有临床标本的获取均在无菌手术状态下切取，创面标本取材位置为创面边缘全层皮肤组织，标本大小为0.5cm×0.5cm×0.3cm，切取后的标本立即浸泡于福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋。

1.2 材料：兔抗人CD100单克隆抗体，购自eptomics公司；二抗和DAB显色液购自Dako公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色：对组织标本进行切片，将切片在60℃恒温箱中烘烤5h后进行脱蜡。二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ中浸泡各10min；在无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅲ中浸泡各10min，在95%乙醇、70%乙醇中浸泡各5min；自来水洗，磷酸盐缓冲液PBS洗一次5min。新鲜配制枸橼酸钠抗原修复液，用煮沸法进行修复，修复期间用温度计控制温度为95℃～98℃，修复时间为20min。待恢复到室温后，2% H2O2/甲醇溶液中浸泡15min灭活内源性过氧化物酶；5% BSA/PBST溶液室温封闭1h；滴加1：200稀释的一抗，同时每份标本用PBS代替一抗做阴性对照。4℃过夜；第2天取出切片，室温条件下复温20min，PBS洗10min；孵育二抗，室温静置1h；PBST洗3次，每次各10min；使用新鲜配置的DAB显色试剂显色；自来水洗1min；苏木素复染1min，自来水洗1min，1%盐酸乙醇分化30s，自来水洗反蓝15min；脱水：95%乙醇5min，100%乙醇5min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10min，吹干；树胶封片，镜检观察。

1.3.2 免疫组化结果的判读：使用免疫组化染色强度评分法对CD100染色后的组织切片的免疫组织化学染色进行判读。由病理医生在不知晓病例临床资料的前提下进行读片和评分，评分内容包括两部分：免疫组化阳性着色细胞数量和着色强度。其中阳性着色细胞数量评分标准为：0%～5%记0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，>75%记4分；着色强度评分标准为：无着色记0分，淡黄着色记1分，棕黄色着色记2分，棕褐色着色记3分。将两组评分相乘即得到免疫强度评分。0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），5～8分为阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.4 统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用率表示，行卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

根据上文所述的免疫组化染色强度评分方法，按照分四组的方法进行统计，每组的样本量较少，为了便于统计，将CD100阴性及弱阳性表达的标本合并为CD100低表达组，而将阳性及强阳性表达的合并为CD100高表达组。免疫组化结果显示，CD100分子在正常皮肤组织中主要表达于表皮，其中胞膜高表达90.0%（18/20），胞质65.0%（13/20）高表达，而真皮组织中不表达。急性创面中表皮组织胞膜CD100表达水平较正常组织明显降低，93.3%（28/30）低表达，胞质63.3%（19/30）低表达，真皮组织CD100分子低表达86.7%（26/30）。慢性创面表皮组织CD100胞膜低表达90.0%（18/20），而真皮组织CD100表达显著升高，65.0%（13/20）高表达。由表1可知，急、慢性创面组CD100在表皮细胞膜中的表达水平显著低于正常皮肤组织，差异有统计学意义（P<0.001）。三组间CD100在表皮细胞细胞质中的表达水平比较，差异有统计学意义（P=0.013），其中慢性创面组较正常组织组表达显著降低（P<0.05）。慢性创面组CD100在真皮中的表达较急性创面组和正常组织组显著升高（P<0.001）。CD100在各类型组织中的染色结果见图1～2。

3 讨论

慢性创面的病因非常复杂，涉及诸多内外因素。从宏观上，组织绝对量不足、局部血液循环差及糖尿病等自身环境是造成创面难愈的病因[2，7]。从分子水平，某些刺激创面修复的蛋白、细胞因子表达异常或功能缺陷可能是引起创面难愈的分子机制[8]。CD100是脑信号蛋白中的一员，最初发现其具有调节神經细胞轴突导向及调节免疫反应的重要作用。诸多研究表明，CD100能够作用于皮肤组织的多种细胞类型，影响其生物学功能。上皮细胞表达CD100的高亲和力受体神经丛蛋白B1（PlexinB1），CD100结合PlexinB1后激活下游信号通路，促进角质形成细胞的迁移和增殖，加速上皮化进程[9]；内皮细胞也高表达PlexinB1，CD100能够促进血管内皮细胞的骨架重塑、迁移及微血管腔和分支结构的形成[10-13]。血小板同时表达CD100及其受体CD72和Plexin-B1[14]，创伤引起的血管损伤后，血小板活化经金属蛋白酶ADAM17水解膜型CD100释放可溶型CD100（sCD100）。sCD100结合内皮细胞表面受体，诱导内皮细胞的血管生成[15]。Witherden等报道，在动物创伤愈合模型中，小鼠树突状上皮γδ-T表面的CD100分子对于促进创面愈合过程起关键作用。皮肤局部树突状上皮γδT细胞（dendritic epidermal γδT cells， DETCs）表达的CD100，结合受损上皮细胞表达的 Plexin-B2后，通过Erk和cofilin信号途径使DETCs失去突起而变圆，并分泌角质形成细胞生长因子（KGF），诱导角质形成细胞增殖和迁移，恢复上皮层的完整性，促进皮肤创面愈合。CD100-/-小鼠中，创面愈合时间较野生型小鼠相比显著延迟[16-17]。综上所述，CD100在创面愈合的过程中发挥重要的作用。

本研究采用免疫組化法研究CD100在临床急性创面、慢性创面及正常皮肤组织标本的表达。结果显示，在正常皮肤组织、急性创面以及慢性创面边缘皮肤中，CD100呈现不同的表达格局：正常皮肤组织中CD100主要表达于表皮细胞膜，真皮不表达；急性创面中表皮CD100膜表达水平与正常组织相比显著降低。有研究证实CD100分子胞外存在蛋白水解位点，金属蛋白酶ADAM17、MT1-MMP均可以水解CD100分子从细胞膜上释放出来[18-19]。细胞活化时膜型CD100易于脱落释放，形成sCD100。因此推测急性创面膜型CD100表达降低可能由于皮肤组织受损时表皮细胞活化，膜型CD100分子被蛋白酶切割而从膜表面脱落，形成sCD100，这个过程可能对创面愈合的起始发挥重要作用。而慢性创面的CD100表达特征是表皮组织低表达而真皮表达显著升高。慢性创面的病因复杂，影响因素众多，大都存在创面感染、局部血供不良、营养不良等共性因素；在分子水平，多种生长因子、细胞因子和趋化因子水平发生改变，引起创面修复停留在炎症期。推测慢性创面表皮CD100表达降低的原因可能同样是由于膜型分子的脱落释放。而CD100广泛表达于免疫细胞，并且在淋巴细胞活化后表达显著上调[20]，真皮CD100表达显著升高的原因是由于慢性创面炎性细胞浸润较多，炎性细胞表面高表达CD100，因此真皮组织CD100表达增高。本研究组利用糖尿病小鼠建立创面模型，给创面局部给予重组表达的sCD100蛋白，能够通过促进血管生成和减轻炎症反应来促进创面愈合[21]。因此推测，慢性创面表皮持续性低表达CD100，不能刺激释放sCD100致创面局部，而真皮免疫细胞高表达CD100的慢性炎症状态可能和创面难愈有关。

本研究的局限性在于没有区分CD100表达的具体的细胞类型，且临床标本的数量较少，无法进行相关性分析，后续仍需收集更多临床标本，对CD100调节创面愈合的作用机制进行进一步深入研究。

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[收稿日期]2018-06-12 [修回日期]2018-07-13

編辑/朱婉蓉