杨娥 李欢 刘艳 徐纪茹

[摘要]目的：本研究拟通过多序列分型（MLST）方法研究是否存在某些和痤疮发病密切相关的基因型。方法：分离培养痤疮患者和健康志愿者皮肤中的痤疮丙酸杆菌株，进行管家基因扩增、测序、比对，比较不同来源的菌株的基因型、亲缘关系及分子流行病学特征。结果：痤疮患者和健康志愿者皮肤标本痤疮丙酸杆菌检出阳性率分别为80.49%和80.77%，差异无统计学意义（P>0.05）。来自健康志愿者的21个菌株可以被分为8个序列类型（ST），分别是ST3、ST8、ST9、ST10、ST18、ST26、ST27和ST46；而来自于患者的33个菌株仅被分为3个ST，它们是ST3、ST26和ST28。结论：痤疮的发生和皮肤中痤疮丙酸杆菌的阳性检出率并无明显关系，但来自于痤疮患者菌株的ST生物多样性明显降低，ST28等基因型与痤疮的发病密切相关。

[关键词]痤疮丙酸杆菌；多位点序列分型法；分子流行病学；痤疮

[中图分类号]R758.73+3 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）10-0125-04

Abstract： Objective To assess if certain Propionibacterium acnes STs have closed relationship to the developing of acne. Methods Propionibacterium acnes strains isolated from patients with acne and healthy controls were testified by multilocus sequence typing（MLST）， and phylogenetic analysis was carried out with MEGA7 software. Results The positive rates of Propionibacterium acnes in the skin samples of patients with acne and healthy volunteers was 80.49% and 80.77%， respectively， and the difference was not statistically significant（P>0.05）. The 21 strains isolated from volunteers were categorized into 8 different sequence types（STs）， include ST3， ST8， ST9， ST10， ST18， ST26， ST27， ST46 and the 33 strains isolated from patients were only categorized into 3 STs， include ST3， ST26 and ST28. Conclusion There was no significant relationship between the occurrence of acne and the detection rate of Propionibacterium acnes. The STs diversity of Propionibacterium acnes from acne patients were significantly reduced， and strains such as ST28 seems to be closely related to the occurrence of acne.

Key words： Propionibacterium acnes； multilocus sequence typing； molecular epidemiology； acne

寻常痤疮是一种常见的毛囊皮肤慢性炎症性疾病，受累人群主要是青少年及20～30岁成年人，发病率高，临床表现多样，从生理性粉刺到炎症性丘疹、脓疱、结节、囊肿，严重程度和持续时间也因人而异。痤疮的病因较复杂，目前尚未完全明了，很多因素都参与了痤疮的发病，其中内分泌因素、微生物因素、皮脂腺导管的异常角化、免疫因素、精神因素、遗传因素等在痤疮的发病中起了重要的作用[1]。但是在痤疮发病的各个阶段，总是伴随着或轻或重的炎症反应，当痤疮发生时，局部毛囊皮脂单位中，痤疮丙酸杆菌、白色葡萄球菌及金黄色葡萄球菌等细菌的生长明显增多，抑制它们的生长，痤疮的症状可以得到部分缓解，这说明微生物因素在其中的重要性。其中与痤疮关系最为密切的是痤疮丙酸杆菌，研究表明，该菌可以促进皮肤角栓形成、皮脂过度分泌、刺激炎症应答激活等，在痤疮发生和发展中扮演着重要的作用[2]。

多位点序列分型（Multilocus sequencing typing， MLST） 是一个具有很高分辨能力的微生物分子流行病学分析方法[3]，它是由多位点酶电泳MLEE衍生出来的一种分型方法，通过对微生物多个管家基因（一般为6～11个位点）的片段进行序列测定，来揭示每个位点等位基因的多样性，并根据各位点不同等位基因的排列组合谱所形成的序列类型（Sequence type，ST），来提供细菌基因组信息，在追查病原菌的传染源、传播途径等方面均有重要意义。本研究通过分离培养患者及健康人群皮肤标本中痤疮丙酸杆菌，进行核酸多序列分型，研究该菌的基因分型与痤疮临床疾病的关系，为指导临床治療提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 标本收集：41例寻常痤疮患者用自来水清洗局部皮肤后，选取未破损痤疮皮损用70%的酒精进行消毒，用灭菌粉刺针挤出痤疮内容物至无菌采样拭子，而后采用分区划线法接种于布鲁氏菌血琼脂（Brucella blood agar，BBA）平板。26例健康志愿者采用无菌PBS浸湿棉拭子，于面部前额正中选择4cm×4cm区域由内向外稍用力涂抹采集样本，分区划线法接种于BBA平板。

1.2 痤疮丙酸杆菌的分离、培养及鉴定：将BBA平板置于厌氧罐中37℃恒温培养72～96h，观察琼脂表面是否有肉眼可见的淡黄色、半透明、圆形、凸起的菌落生长。选取可疑菌落进行革兰染色镜检，将镜下呈现革兰阳性、分节状排列、呈杂乱粗大杆菌的单菌落进行双份转种，一份继续厌氧培养，另一份使用VITEK2全自动细菌鉴定系统进行菌株鉴定。

1.3 细菌全基因组DNA提取：分离、培养鉴定到的54株痤疮丙酸杆菌临床株，使用北京TIANGEN公司细菌基因组提取试剂盒提取全基因组DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃冰箱保存备用。

1.4 PCR擴增管家基因：用于PCR扩增的引物序列参照Http：//pacnes.mlst.net/，实验中分析的9个管家基因及其编码产物如下：cel（Transcription regulator ），转录调节因子；coa（O-succinylbenzoate-CoA synthase），O-琥珀酰苯甲酸-CoA合成酶；fba（Fructose bisphosphate aldolase），果糖二磷酸醛缩酶；gms（Glutamyl-tRNA synthetase），谷氨酰-tRNA合成酶；lac（L-lactate dehydrogenase）， L-乳酸脱氢酶；oxc（Cytochrome C Oxidase Subunit Ⅱ），细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ；pak（Pantothenate kinase），泛酸激酶；recA （Recombinase A），重组酶A；zno（Zn-dependant alcohol dehydrogenase），锌依赖性醇脱氢酶。实验所用引物见表1，由北京博奥生物公司合成。

除recA基因以外的其他8个基因PCR反应条件如下：96℃预变性40s；94℃ 35s，55℃ 40s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸7min。recA基因的PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃ 1min，55℃ 30s， 72℃ 90s，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。纯化后送上海生工生物工程技术公司双向测序。测序和PCR反应采用同样的引物，所得序列采用Laser-gene 7.0软件包的SeqMan软件进行拼接和分析。

1.5 MLST序列分析：每个管家基因的测序结果通过与Http：//pacnes.mlst.net/网站上痤疮丙酸杆菌的等位基因序列进行比对，确定所测基因的等位基因类型，得到9个等位基因的组合之后，与网站上等位基因排列组合谱进行比较，即得到实验菌株的ST信息。

1.6 亲缘关系分析：基于MLST 9个等位基因测序信息，利用MEGA7软件采用邻位相连法（Neighbor-joining，NJ）对所分离菌株进行亲缘关系分析。

2 结果

2.1 痤疮丙酸杆菌阳性检出率：本次实验共收集了54株痤疮丙酸杆菌，其中33株来自于41例临床痤疮患者，21株来自于26例健康志愿者，患者和健康志愿者标本中痤疮丙酸杆菌的阳性检出率分别为80.49%和80.77%，该菌在痤疮患者和健康志愿者中的检出率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 PCR扩增管家基因：以54株痤疮丙酸杆临床分离株的基因组DNA为模板，进行9个管家基因PCR扩增，结果如图1显示，PCR产物均条带清晰，目的片段同预期大小一致（DNA Marker为Takara公司的DL2000）。

2.3 MLST分型检测结果：54株菌的9个管家基因PCR产物进行核酸序列测定，序列拼接后与Http：//pacnes.mlst.net/数据库进行比对，如表2所示，这些菌株可以被分为 9个ST，其中来自于健康志愿者的21个菌株可以被分为8个ST，分别是ST3（4例）、ST8（2例）、ST9（3例）、ST10（3例）、ST18（2例）、ST26（2例）、ST27（3例）、ST46（2例）；而33株分离自患者标本的痤疮丙酸杆菌仅可被分为3个ST，分别是ST3（13例）、ST26（6例）和ST28（14例）。

2.4 菌株间亲缘关系分析结果：根据MLST分型结果，利用MEGA7软件采用邻位相连法对本次试验中检测到的9个痤疮丙酸杆菌基因型的亲缘关系进行分析，结果见图2。

3 讨论

痤疮是一种毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，因其主要发生于面部，易反复发作，可以导致瘢痕形成，色素沉着，严重影响美观，给患者带来一系列社会及心理问题从而越来越受到重视[4]。痤疮丙酸杆菌是皮肤生物膜微生物群落的重要组成部分，也是一种机会致病菌。长期以来，人们对于该菌在痤疮的发病过程中到底有何作用具有一定争议。但是来自多中心的临床研究均表明，作用于痤疮丙酸杆菌的不同抗生素、抗菌剂和细菌素是治疗痤疮的有效方法，说明该菌在痤疮发病中应该占有一席之位。

本研究发现，患者痤疮皮损处和健康志愿者皮肤标本中痤疮丙酸杆菌的检出率均比较高，分别为80.49%和80.77%，统计学分析并无显著性差异，痤疮患者的毛囊中并没有比正常人群具有更多的痤疮丙酸杆菌，说明该菌的阳性率显然不是决定痤疮发病的首要因素。利用基于高通量测序的宏基因组研究也同样发现[5]，痤疮丙酸杆菌是皮肤微生物群中最主要和最丰富的细菌，其相对丰度在痤疮和痤疮患者中是相似的（87%～89%），并无明显差异。所以可以推测来自于这两类人群的痤疮丙酸杆菌临床分离株遗传背景应当存在一定差异，某些痤疮丙酸杆菌菌株可能是真正的皮肤共生菌，有助于皮肤健康，而某些菌株则有可能充当机会致病菌诱发痤疮。除了细菌因素外，痤疮患者还普遍存在皮脂分泌过多的问题，这可以造成毛囊皮脂腺淤积即脂肪栓形成，局部微环境中氧分压下降，从而有利于痤疮丙酸杆菌的增殖。而痤疮丙酸杆菌又可以摄取皮脂中的甘油三酯作为营养物质进行生长繁殖，产生很多胞外酶如包括脂酶、蛋白酶、透明质酸酶等，从而加重痤疮毛囊局部的炎症。并促进毛囊漏斗部角化增强形成粉刺，进一步导致皮脂排泄不畅，加重了毛囊皮脂腺过度增生，从而有利于痤疮的发生和发展[6]。

基于管家基因测序分析的MLST分型方法简单，快速，重复性好，分辨率高，结果准确，可用于研究几乎所有细菌（特别是难以培养的细菌），并可直接用于检测细菌培养阴性的可疑临床标本。由于其数据源于高通量核苷酸序列测定技术，故易于对来自于不同实验室的数据进行快捷的比较分析，被认为是进行大规模全球性流行病学研究“金标准”，更易于解释菌株与流行病学之间的相关性，也易于在不同实验室间作分析比对[7]。

通过MLST基因分型方法发现，定植在痤疮患者与健康人毛囊皮脂腺处的痤疮丙酸杆菌菌株存在差异。来自健康人群标本中的痤疮丙酸杆菌的序列类型具有更丰富的生物多样性，21株临床分离株的基因型可以被分为8个ST，分别是ST3（4株）、ST8（2株）、ST9（3株）、ST10（3株）、ST18（2株）、ST26（2株）、ST27（3株）、ST46（2株）；而从患者标本中分离培养到的痤疮丙酸杆菌菌株的生物多样性大大降低了，33株临床分离株的基因型集中在3个ST，分别为ST3（13株）、ST26（6株）和ST28（14株），这说明痤疮病变的发生仅与某些特定ST的菌株有关。虽然本研究中ST3和ST26也见于健康人群，但是在痤疮患者中更为常见，而ST28在本次研究中只见于痤疮患者，同样说明健康志愿者和痤疮患者皮肤分离到的痤疮丙酸杆菌菌株的多样性和主要ST类型均存在差异。对于分离到ST3和ST26的健康志愿者，应当进行后续的回访，观察他们是否有可能会发生痤疮。

基于MLST的痤疮丙酸杆菌的研究自从Lomholt HB等2010年建立了9个管家基因的方法学以来[8]，取得了很多进展。研究结果显示，不同地区、不同种族痤疮患者的痤疮丙酸杆菌基因型存在差异。点突变导致痤疮丙酸杆菌出现新等位基因比重组的多1.5倍，eST3和痤疮的发生高度相关，尤其是rRNA变异的eST3更常见且与耐药菌株密切相关，而CC72 （type Ⅱ） and CC77 （type Ⅲ）仅仅见于健康人群[9]；CC18是导致背部痤疮的优势克隆复合体，特别是与高加索地区人群的痤疮发病密切相关[10]；前列腺癌标本中的优势克隆复合体是CC53/60和CC36[11]。ST1和ST3与痤疮丙酸杆菌的耐药性密切相关[12]且ST3基因型菌株可以在人单核细胞中诱导产生促炎因子如IFN-γ和IL-17[13]，从而更容易适应高活性脂溢性皮腺皮肤，加重痤疮的发生。

在对本研究中的痤疮丙酸杆菌亲缘关系分析發现，ST9、ST10、ST8、ST18这些菌株的亲缘关系比较密切，它们仅见于健康志愿者。而ST3、ST26、ST28和ST27亲缘关系更为密切，后四种ST中，ST3、ST26和ST28都是在痤疮患者中更多见，这进一步说明痤疮的发生和发展可能与痤疮丙酸杆菌菌株的ST差异有一定关系，这几个基因型和痤疮发生的关系如何尚需要进一步扩大样本量来进行深入研究，或者进行动物实验验证，所得结果可为临床痤疮的防控提供理论依据。

[参考文献]

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[收稿日期]2018-07-12 [修回日期]2018-09-14

编辑/朱婉蓉