王茜,刘歧,赵钢

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

黄柏水溶液对大鼠下肢静脉性溃疡创面修复中NF-κB、TNFAIP3/A20表达的影响

王茜1,刘歧1,赵钢2*

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究黄柏水溶液对大鼠下肢静脉性溃疡创面修复中NF-κB、TNFAIP3/A20表达的影响。方法: 将雄性SD大鼠80只随机平均分为假手术组、模型组、治疗组(黄柏水溶液)和对照组(复方黄柏液)。每组又分为7d和14d两个时间点，每个时间点10只。分别于治疗第 7天 , 第14天采用数码相机照相电子计算机软件分析及透明生物膜描膜法观察溃疡创面愈合情况。治疗第7、14天进行血流变及DD检测，ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。取创面组织进行病理学检测，同时用PCR检测NFκB、IκB、TNFAIP3的表达。结果:治疗组与模型组比较，效果明显，愈合率显著升高，溃疡面积不断缩小，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，IL-1β、IL-6、TNF-α的含量降低明显，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较NF-κB mRNA水平下降，IκBα、TNFAIP3/A20的水平上调，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗14天的效果要优于药物治疗第7天。各项指标结果显示，对照组于治疗组没有明显差异。结论:黄柏水溶液抑制了大鼠下肢静脉性溃疡创面修复中的NF-κB的表达，促进了TNFAIP3/A20的表达。

黄柏水溶液；下肢静脉性溃疡；创面修复

下肢静脉性溃疡是外科常见病、多发病, 是下肢慢性静脉功能不全后期的主要临床表现之一[1],中医称“臁疮”“老烂腿”, 该病可导致慢性疼痛、残疾、生活质量下降，常见发病部位为小腿中下段前内侧面,即足靴区，其次是内踝、外踝和足背区[2]，深静脉瓣膜功能不全引起的静脉高压是下肢静脉溃疡的主要原因。黄柏功效为清热燥湿，泻火解毒，外治法治疗痈疽疮毒，皮肤溃疡等[3]。

本研究将对黄柏水溶液治疗实验大鼠皮肤溃疡中的基因表达以及可行性通络进行验证，为其临床治疗下肢静脉性溃疡提供临床依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性SD大鼠80只，SPF级，体质量(250±20)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,许可证号：SCXK鲁20140001。在安静环境下适应性饲养1周，室温(22±2)℃，相对湿度55%～60%。给予充足清洁饮水，自由摄食。

1.1.2 实验药物及仪器

黄柏水溶液(10 mL/支，含生药0.3 g。由黑龙江中医药大学附属一院药厂生产制备);复方黄柏液(山东汉方制药有限公司生产);戊巴比妥钠(天津市光复精细化工研究所生产)。

显微镜：(日本OLYMPUS)；HD-850型桌上式洁净工作台(苏州净化)；美国moticam3000显微摄影成像系统；电子天平(梅特勒—托利多仪器上海有限公司)；切片机，包埋机，脱水机(德国 Leica公司);磁力加热搅拌器(德国IKA公司)；全自动梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)；PCR反应扩增仪(美国Bio-Rad公)；凝胶成像系统(以色列MiniLumi公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备

1.2.1.1 大鼠下肢深静脉血栓形成模型制备

在无菌操作台上，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剪去左侧大腿根部毛发,仰卧位固定。常规无菌消毒,铺好无菌孔巾。在左侧腹股沟内侧做长约2 cm切口,分离皮下组织和浅筋膜等,分离并暴露髂-股静脉约1.0 cm。在其近、远心端用动脉夹夹闭此静脉,然后用自制无齿的12号蚊式钳夹闭血管，于动脉夹位置相邻，力量为血管钳紧1扣,时间持续2～3 s。松开蚊式钳并进行缝合,局部皮肤常规消毒。手术后24 h,将放置血管夹取出[4]。

1.2.1.2 局部皮肤缺损模型

下肢深静脉血栓模型制备成功3 d后, 在无菌操作台上，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪去左侧大腿外侧毛发，保证皮肤完整无破损,然后取适量脱毛膏脱毛, 直径约为3 cm。大鼠俯卧位固定，局部皮肤常规无菌消毒,铺好无菌孔巾,用直径1.5 cm打孔器标记造模位置,剪取标记位置全层皮肤,造成直径1.5 cm圆形皮肤缺损，深度达皮下深筋膜。大鼠分笼单个饲养，笼具内铺垫无菌纱布，同时注意保暖，观察大鼠皮损变化和一般行为状态。

1.2.2 实验大鼠分组治疗

将 80只大鼠随机平均分为模型组、黄柏水溶液组和阳性药对照组(复方黄柏液)。另设假手术组，除不夹闭血管和剪去皮肤外，其余操作同模型组。每组又分为7 d和14 d两个时间点，每个时间点10只。黄柏组在创面喷黄柏水溶液，为0.5 mL/创面，每天一次；复方黄柏组在创面喷复方黄柏液，0.5 mL/创面，每天1次。治疗14天。

1.2.3 溃疡创面的面积计算

于造模后药物治疗的第7天，第14天用数码相机照相经Photoshop软件分析及透明生物膜覆盖创面并沿创缘描膜以记录创面面积,计算创面愈合率。创面愈合率=(初始面积-未愈合面积)/初始面积×100%。

计算皮肤溃疡剩余面积[5]。

1.2.4 溃疡创面的组织学检查

于造模后药物治疗的第14天切取皮肤溃疡创面组织，置于10%中性福尔马林固定液中，常规石蜡包埋、切片，经苏木精-伊红(HE)染色，在光镜下观察溃疡创面愈合的情况。

1.2.5 ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平

按照ELISA试剂盒说明，使用酶标仪检测各样本的吸光度A，计算IL-1β、IL-6 和TNF-α的各组小鼠血清中的浓度。

1.2.6 RT-PCR法检测溃疡组织中NFκBp65、IκBα和TNFAIP3mRNA表达

溃疡组织中总DNA提取按Trizol试剂说明书进行。取2 μgRNA 在逆转录酶催化下合成DNA，用Podocin引物对cDNA 进行半定量PCR扩增,采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录,NFκBp65:上游引物:GCTCCTTTTCTCAAGCCGATGT;下游引物:CGTAGGTCCTTTTGCGTTTTTC。IκBα：上游引物：ACGAGGATTACGAGCAGATGGT；下游引物：GCAGGTTGTTCTGGAAGTTGAG。TNFAIP3：上游引物：GCAGTGTAAAAGGCAGGCTAAC；下游引物：TGGGGTTCTCTCTCGTATCTTC。GAPDH：上游引物：TTCCTACCCCCAATGTATCCG；下游引物：CATGAGGTCCACCACCCTGTT。数据采用2-△△CT法进行分析，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般状态的变化

大鼠造模后陆续出现下肢肿胀、皮色暗红,溃疡创面有脓性分泌物渗出，食量减少、饮水减少、少动、弓背等症状。给药后复方黄柏液组与黄柏水溶液组症状缓解较模型组明显。

2.2 大鼠溃疡面积以及愈合率的变化

由数据可示，随着时间的进展，治疗组与模型组比较效果明显，愈合率显著升高，溃疡面积不断缩小，P<0.05，具有统计学意义。见表1。

表1 大鼠溃疡面积与愈合率数值

注：与假手术组比较，*P<0.05

2.3 组织病理学变化

假手术7天组：细胞呈梭形,组织细胞结构排列整齐,大小均匀。模型7天组：炎细胞大量出现，组织水肿明显，红细胞明显，组织细胞结构疏松。黄柏水溶液7天组：组织水肿开始消退，炎细胞减少，结缔组织开始增生。复方黄柏液7天组：组织水肿开始消退，炎细胞减少，结缔组织开始增生。黄柏水溶液14天：组织水肿消失，炎细胞减少明显几乎消失，结缔组织增生明显。复方黄柏液14天组：水肿消失，炎细胞消失不见，结缔组织大量增生。

HE染色图片(×400)见图1。

图1 大鼠组织病理学变化 注：A：假手术7天组;B：模型7天组;C：黄柏水溶液7天组;D:复方黄柏液7天组;E：黄柏水溶液14天组;F：复方黄柏液14天组

2.4 血液学检测

通过数据检测可看出，模型组与假手术组的血流变及血浆D-二聚体比较发现，模型组指标均高于假手术组，P<0.05，具有统计学意义。治疗组与模型组的血流变及血浆D-二聚体比较可看出，治疗组效果明显，P<0.05，具有统计学意义。对照组与治疗组对比发现，P>0.05，不具有统计学意义，所以只能证明大鼠下肢静脉性溃疡模型的成功建立，以及黄柏水溶液治疗的有效性。(见表2、3)

2.5 ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平结果

检测数据提示，与假手术比较，模型组各项指标数值更高，说明炎症反应比假手术组重，模型成立。在给药方面，治疗组在7、14天与模型组比较，指标数值明显降低，P<0.05，具有统计学意义，说明黄柏水溶液效果明显。对照组14天与治疗组14天的比较中，不具有差异，P>0.05,不具有统计学意义。见表4。

2.6 RT-PCR法检测溃疡组织中NFκBp65、IκBα和TNFAIP3mRNA表达

以上数据表明，NFκBp65表达上，假手术组与模型组对比明显表达量较少，有显著性差异，P<0.05。治疗组与模型组对比可见，NFκBp65表达量减少，说明黄柏药物有效性，有显著性差异，P<0.05。在IκBα基因表达上，假手术组表达明显高于模型组，有显著性差异，P<0.05；治疗组与模型组比较，表达上也高于模型组，有显著性差异，P<0.05；在治疗第14天时，治疗组与对照组对比得出P>0.05，不具有统计学意义，说明治疗组与对照组没有明显差异。TNFAIP3基因表达上可见，假手术组表达明显高于模型组，有显著性差异，P<0.05；治疗组与模型组比较，表达上也高于模型组，有显著性差异，P<0.05；对照组与治疗组比较P>0.05，不具有统计学意义。见表5。

表2 血浆D-二聚体(DD)、纤维蛋白原(FIB)检测数值变化

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表3 全血黏度200s 、RCAI、CP检测结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表4 IL-1β、IL-6、TNF-α检测结果

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表5 各组基因的变化水平

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

下肢静脉性溃疡，由于各种原因引起的下肢静脉瓣膜功能不全，静脉血流动力学发生改变，产生浅静脉、深静脉或交通支静脉血液异常反流，引起静脉压力升高，而形成的难治性溃疡。目前医学上尚无满意的药物及疗法，但是中医药对本病的治疗具有其独特的优势。下肢静脉性溃疡属中医“臁疮”的范畴，其为本虚标实之证，气虚血瘀为基本病机，益气活血消除下肢瘀血是治疗的关键。临床上外用治疗常用的有复方黄柏液，生肌玉红膏等中成药物。

检测指标中的血流变以及血浆第二聚体为衡量血栓的重要指标，可用来证明模型的成立。α肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)是具有众多生物学活性的细胞因子，是由多核巨细胞产生。Carswell[6]等,最早命名其为肿瘤坏死因子。TNF-α由活化的单核巨噬细胞产生,又称恶液素[7]。TNF-α是炎性细胞因子，参与全身炎症反应通过产生IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等因子引起炎症[8]。IL-1β：白细胞介素1 (interleukin-1,IL-1)拥有众种生物学效应，特别在炎症反应、免疫调节，调整创伤组织的修复过程中作用明显，也是体内作用较强的炎症细胞因子[9]。IL-6：IL-6由所有经过TNF-α和 IL-1诱导的细胞核组织产生。IL-6拥有致炎作用和抗炎作用[10]。本实验通过酶联反应检测创面组织中的IL-6、IL-1β 、TNF-α的变化，得出黄柏水溶液能够有效地降低三种因子的表达，从而抑制了炎症反应的发生，达到了治疗溃疡的目的。

NF-KB是具有转录激活调节功能的一种蛋白。正常情况下,NF-kB同IkB(inhibitor of NF-KB)即抑制因子相结合,对调节基因的转录功能进行抑制。调节促炎因子和抗炎因子[11]等。IL-10通过抑制IKK(IkB激酶)的活性,达到抑制NF-KB活化，同时加快了炎症因子IL-1,IL-6,IL-8,G-CSF的mRNA的降解,降解后产物将导致NF-kB的持续活化,让炎症持续放大,从而炎症再次加重[12]。 TNFAIP3为肿瘤坏死因子诱导蛋白，A20是其编码的泛素化蛋白[13]。A20蛋白抑制NF-KB的表达和细胞凋亡[14]。TNFAIP3也是自身免疫性炎症反应形成的重要的候选基因[15]。在生理状态下,NF-KB与其抑制蛋白IKB结合,以无活性的复合体形式存在于细胞浆中,适当的外来信号可导致IKB磷酸化降解,NF-KB活化并向细胞核内移位,与相应的DNA位点结合,启动A20的转录和表达[16]。A20可通过多个不同的机制抑制IKB的磷酸化,而使IKB含量增加，从而抑制NF-KB的功能[17]。本研究通过对TNFAIP3/A20的基因表达测定得出了，在下肢溃疡模型愈合过程中，A20表达越高，创面愈合情况越好，这就证明中药黄柏可以通过刺激A20而使IKB含量增高，抑制了NF-KB 含量，达到抑制炎症反应的目的，从而使创面愈合加快。

本课题从各项相关指标来评价黄柏水煎液治疗下肢静脉性溃疡的疗效。结果证明:黄柏水溶液可以明显缓解下肢静脉性溃疡患者的临床表现,促进创面的愈合。各项指标及疗效评价与模型组比较(P<0.05),有统计学意义。应用黄柏水溶液是治疗下肢静脉性溃疡安全有效的方法。

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Wound-HealingEffectofAqueousSolutionofCortexPhellodendriontheExpressionsofNF-κβandTNFAIP3/A20inRatswithVenousUlcerofLowerLimbs

WANG Xi1, LIU Qi1, ZHAO Gang2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To investigate the wound-healing effect of aqueous solution ofCortexPhellodendrion the expressions of NF-κβ and TNFAIP3/A20 in rats with venous ulcer of lower limbs. Methods: 80 male SD rats were randomly divided into the sham surgery group, the model group, the observation group(aqueous solution ofCortexPhellodendri), and the control group(Compound Phellodendron Liquid). Each group was subdivided by 7 d and 14 d, 10 rats at each time point. Wound-healing degree was observed, tests of hemorheology DD were performed, serum levels of IL-1β, IL-6, and TNF-a, as well as the expressions of NF-κβ and TNFAIP3/A20 were detected on 7th and 14th day respectively. Results: The effect of the observation group was more obvious, the healing rate increased more significantly, the area of the ulcer was narrower, compared to the model group, and the difference was statistically significant(P<0.05). The levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α were decreased significantly, and the difference was statistically significant, compared to the model group(P<0.05). The expression of NF-κβ was reduced, but TNFAIP3/A20 was raised when compared to the control group, with a significant difference(P<0.05). 14 d treatment was better than 7 d treatment. It showed that there were no obvious difference between the observation group and the control group in the above indicators. Conclusion: Aqueous solution ofCortexPhellodendrican inhibit the NF-κβ expression and promote TNFAIP3/A20 expression, which may be related to its wound-healing effect in rats with venous ulcer of lower limbs.

Aqueous solution ofCortexPhellodendri; Venous ulcer of lower limbs; Wound-healing

R285.5

A

1002-2392(2017)06-0052-05

2017-08-02

2017-09-10

哈尔滨市科技创新人才研究专项资金(青年后备人才计划类)(2016RAQXJ209)

王茜(1986-),女,博士研究生,研究方向:中西医结合治疗周围血管系统疾病及其并发症。

*通讯作者：赵钢(1958-),男,主任医师,博士研究生导师,研究方向:中西医结合治疗周围血管系统疾病及其并发症。