叶家欣，马丹丹，王世杰，蔡逊，张智勇，张建新

(中国人民解放军武汉总医院, 武汉430070)

·临床研究·

肝癌组织FAM96B表达变化及其意义

叶家欣，马丹丹，王世杰，蔡逊，张智勇，张建新

(中国人民解放军武汉总医院, 武汉430070)

目的观察肝癌组织96序列相似家庭成员B(FAM96B)mRNA和蛋白表达变化，并探讨其临床意义。方法选择42例肝癌患者，采用实时荧光定量PCR法检测肝癌组织及癌旁正常肝组织中FAM96B mRNA表达,采用Western blotting法检测FAM96B蛋白表达，并分析肝癌组织FAM96B蛋白表达与患者临床病理参数的关系。结果肝癌组织和癌旁正常肝组织FAM96B mRNA相对表达量分别为0.423±0.096、1.649±0.268，FAM96B 蛋白相对表达量分别为0.845±0.131、1.548±0.234。肝癌组织和癌旁正常肝组织FAM96B mRNA和蛋白相对表达量比较，P均<0.05。肝癌组织FAM96B蛋白相对表达量与肝癌大小、门静脉癌栓、肝外转移、Child分级、BCLC分期有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤数目、乙肝、肝硬化、血清AFP无关(P均>0.05)。结论肝癌组织FAM96B mRNA和蛋白表达降低。检测肝癌组织FAM96B蛋白表达量有助于判断患者病情。

肝癌；96序列相似家庭成员B基因; 96序列相似家庭成员B蛋白

肝癌的发生、发展是包括癌基因激活或(和)抑癌基因失活在内的多阶段多步骤过程[1～3]。96序列相似家庭成员B (FAM96B) 又称CGI-128、MIP18或HSPC118, 包含5个外显子，编码163个氨基酸，染色体定位于16q22.1～22.3，分子量约为18子量(约3D)，其生物学功能尚不明确[4～7]。目前尚未见关于FAM96B与肝癌关系的报道。本研究观察了肝癌组织FAM96B mRNA和蛋白表达变化,分析肝癌组织FAM96B蛋白表达量与患者临床病理参数的关系，并探讨其临床意义。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1～12月我院收治的肝癌患者42例，均经术后病理检查确诊。取手术切除的肝癌组织和癌旁正常肝组织标本(距肿瘤边缘>2 cm且病理检查确定为正常肝组织)。本研究已经获得我院医学伦理委员会批准，所有患者已签署知情同意书。

1.2 FAM96B mRNA检测 参照TRIzol试剂盒操作说明书提取42例患者肝癌组织及癌旁正常肝组织的总RNA。用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，低温保存备用。采用实时荧光定量PCR法检测FAM96B mRNA。PCR反应体系为20 μL，其中2×SYBR Green mix缓冲液10 μL，上下游引物各0.6 μL(浓度为10 μmol/L)，cDNA 2 μL，DEPC水补齐至20 μL。FAM96B上游引物序列为5′-GGAGTTGAACGTAGTAGAGCAGG-3′，下游引物序列为5′-GACAGACCAATAAGGGTGGC-3′；β-actin上游引物序列为 5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，下游引物序列为5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。引物均由上海英骏生物工程技术服务公司设计并合成。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸5 min。每个样本均做3个复孔，并重复3次。采用2-ΔΔCt法计算FAM96B mRNA相对表达量。

1.3 FAM96B蛋白检测 采用Western blotting法。称取肝癌组织和癌旁正常肝组织各0.08 g，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。各取120 μg上样于5%浓缩胶和15%分离胶，行SDS-PAGE分离。转移蛋白于PVDF膜，给予5%脱脂奶粉稀释的FAM96B及βAM96B一抗封闭，4 ℃过夜，HRP标记二抗37 ℃温育, 化学发光法显影。以β-actin为内参照。用灰度扫描仪获得FAM96B蛋白条带和β-actin条带的灰度值，FAM96B蛋白相对表达量以FAM96B蛋白条带和β-actin条带灰度值之比表示。

2 结果

2.1 肝癌组织和癌旁正常肝组织FAM96BmRNA和蛋白相对表达量比较 肝癌组织和癌旁正常肝组织FAM96B mRNA相对表达量分别为0.423±0.096、1.649±0.268，FAM96B蛋白相对表达量分别为0.845±0.131、1.548±0.234。肝癌组织和癌旁正常肝组织FAM96B mRNA和蛋白相对表达量比较P均<0.05。

2.2 肝癌组织FAM96B蛋白相对表达量与患者临床病理参数的关系 肝癌组织FAM96B蛋白相对表达量与肝癌大小、门静脉癌栓、肝外转移、Child分级、BCLC分期有关(P均<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤数目、乙肝、肝硬化、血清AFP无关(P均>0.05)。见表1。

表1 肝癌组织FAM96B蛋白相对表达量与患者临床病理参数的关系

3 讨论

观察某种基因在肿瘤组织及其相应邻近正常组织的差异性表达是分析基因与肿瘤关系的最常用方法，异常表达的基因可能在肿瘤的形成过程中扮演重要角色，可认为是潜在的新一类控制细胞增殖和凋亡的癌基因或抑癌基因[8～10]。本研究结果显示，FAM96B mRNA和蛋白在肝癌组织中的相对表达量均显著低于癌旁正常肝组织。提示FAM96B在肝癌发生、发展过程中扮演重要角色。可能是抑癌基因或者通过间接作用抑制肝癌和其他其他肿瘤的发生、发展。有研究证实，FAM96B在人结肠癌组织中的表达阳性染色主要定位于细胞质，并指出其在人类结肠癌组织中低表达[11，12]。这与本研究结果基本一致。

本研究还观察了肝癌组织FAM96B蛋白表达量与患者临床病理参数的关系，结果显示FAM96B在肝癌组织中低表达与肝癌患者的性别、年龄、肿瘤数目、乙肝、肝硬化、血清AFP无关。目前临床上已经明确肝癌的发生与乙肝和肝硬化密切相关。本研究结果显示，FAM96B表达与乙肝与否及有无肝硬化无相关性，此研究结果可能需要更加深入地研究来论证。目前，血清AFP在临床上被用来筛查早期肝癌和评价患者预后。但只有40%～60%的肝癌患者血清AFP升高。因此单用血清AFP来诊断肝癌容易造成漏诊[13]。本研究结果显示，FAM96B有潜力成为不依赖AFP的肝癌标记物。肿瘤侵袭转移是导致癌症患者死亡的主要原因之一，肿瘤细胞离开原发灶并侵入周围组织和(或)侵袭血管与淋巴管进入循环系统向远处组织扩散形成新的转移灶，在血供充分的情况下增殖形成转移瘤。本研究结果显示，FAM96B在肝癌组织中低表达与肿瘤大小、门静脉癌栓、肝外转移、Child分级、BCLC分期显著相关。提示FAM96B可能是一个与肝癌侵袭转移相关的分子指标，在肝癌发展、浸润及转移中起到一定的抑癌基因作用。

综上所述，肝癌组织FAM96B mRNA和蛋白表达降低。检测肝癌组织FAM96B蛋白表达量有助于判断患者病情。FAM96B可能是一个在肝癌发生发展、侵袭转移过程中发挥抑制作用的抑癌基因，并且可能成为一个新的肝癌生物学标志物。然而本研究也存在一些不足，如样本量不足、未进行体内实验及靶基因探讨。下一步将扩大样本量在体内动物实验中进一步验证 FAM96B在肝癌中的生物学作用、机制和临床意义。

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国家自然科学基金资助项目(81350006)；湖北省自然科学基金资助项目(2012FFB06805)。

蔡逊(E-mail： caiwenqian@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.015

R735.7

B

1002-266X(2017)40-0053-03

2017-03-10)