任琦，孙淑丰，李玉红，朱凌妍，牛琛，冯福民

(华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063210)

ADLI大鼠肝组织DNA羟甲基化变化及其机制

任琦，孙淑丰，李玉红，朱凌妍，牛琛，冯福民

(华北理工大学公共卫生学院，河北唐山063210)

目的探讨抗结核药物性肝损伤(ADLI)形成过程中DNA羟甲基化变化及其机制。方法选择SD大鼠96只，随机分为异烟肼组、对照组各48只。异烟肼组给予异烟肼55 mg/(kg·d)灌胃，对照组给予等体积蒸馏水灌胃。两组分别于灌胃3、7、10、14、21、28天各随机取8只，麻醉后心脏取血，检测血浆ALT、AST；处死后留取肝组织，HE染色，观察肝组织病理变化；采用RT-PCR法检测肝组织谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)基因C、甲基胞嘧啶(5mC)、氧化成羟甲基胞嘧啶(5hmC)含量；采用ELISA法检测肝组织10-11易位蛋白1(TET1)蛋白表达，RT-PCR法检测TET1 mRNA表达。结果随着给药时间延长，异烟肼组肝损伤程度逐渐加重；其GSTP1基因C含量随着肝损伤程度加重呈下降趋势，而5mC含量先上升，至灌胃14天略有回落，随后继续上升；5hmC含量呈现下降趋势，至灌胃21天降至最低，灌胃28天时略有回升；而TET1蛋白水平及其mRNA表达与5hmC含量变化基本一致。结论DNA羟甲基化可能参与了ADLI的发生。

药物性肝损伤；异烟肼；DNA甲基化；DNA羟甲基化；谷胱甘肽S-转移酶P1；10-11易位蛋白

异烟肼是WHO推荐的一线抗结核药物，但长期应用可导致抗结核药物性肝损伤(ADLI)[1]。研究发现，在ADLI发生、发展过程中常伴有DNA甲基化异常表达[2]。谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)在抗结核药物的代谢及肝脏解毒过程中发挥重要作用，其启动子区CpG岛甲基化异常可能参与ADLI的发生[3]。以往认为，DNA甲基化是一个非常稳定的表观遗传学改变，但随着DNA羟甲基化的发现，人们逐渐意识到甲基化过程是动态可逆的，并认为羟甲基化可能参与DNA去甲基化过程[4]。在这一过程中，10-11易位(TET)蛋白家族发挥了至关重要的作用[5]。TET家族蛋白共有TET1、TET2、TET3三种亚型，在二价铁离子和α-酮戊二酸依赖性氧化酶的共同作用下，TET家族蛋白可将甲基胞嘧啶(5mC)氧化成羟甲基胞嘧啶(5hmC)，且在胸腺嘧啶DNA糖基化酶和去甲基酶的共同作用下，5hmC可通过碱基切除修复进一步逆转5mC修饰[6]。因此，5hmC可能是DNA去甲基化过程的中间产物和关键环节。2015年9月～2016年6月，我们观察了异烟肼致ADLI大鼠肝组织GSTP1基因胞嘧啶(GSTP1基因C)、5mC、5hmC和TET1蛋白及其mRNA表达变化，现分析结果，旨在探讨ADLI的发生机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD大鼠96只，SPF级，雌雄各半，8～9周龄，体质量258～365 g，异烟肼(沈阳红旗制药有限公司，规格：100 mg/片)。全自动生化分析仪(日本日立公司)；高速冷冻离心机(德国Thermo Fisher Scientific公司)；PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)；荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。TRI pure Reagent 总RNA抽提试剂盒和TET1 ELISA试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；Platinum SYBR Green qPCR试剂盒、莫洛尼鼠类白血病病毒(M-MLV)试剂盒(美国Invitrogen公司)；DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；5mC-5hmC分析试剂盒(美国NEB公司)。

1.2 动物分组及ADLI模型制备 随机将96只大鼠分为异烟肼组和对照组，每组48只。异烟肼组参照查月芳等[7]的方法建立ADLI模型，即以异烟肼55 mg/(kg·d)连续灌胃；对照组同期给予等体积蒸馏水连续灌胃。

1.3 相关指标观察 两组分别于灌胃3、7、10、14、21、28天各随机取8只大鼠，麻醉后心脏取血，分离血浆，-40 ℃保存；处死后留取肝组织，-80 ℃保存。观察以下指标。

1.3.1 肝损伤情况 ①血浆ALT、AST水平：采用全自动生化分析仪以速率法检测血浆ALT、AST。②肝组织病理变化：取部分肝组织，4%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，5 μm厚切片，常规HE染色，显微镜下观察肝组织病理改变。

1.3.2 肝组织GSTP1基因C、5mC、5hmC表达 取肝组织50 mg，剪碎，提取肝组织DNA后，PCR扩增获得GSTP1基因片段。GSTP1上游引物：5′-CATCCTTCCACGCACATCCTC-3′，下游引物：5′-CGTTACTTGGCTGGTTGATGTC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGGACTAGCAAGCAGGAGT-3′，下游引物：5′-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。PCR反应条件：94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，65 ℃ 5 min，共35个循环。根据5mC-5hmC分析试剂盒说明检测GSTP1基因C、5mC和5hmC相对表达量[8]。

1.3.3 肝组织TET1蛋白和mRNA表达 ①TET1蛋白表达：采用ELISA法。取肝组织50 mg，超声破碎，制成1∶5组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清。设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入不同浓度的标准品各50 μL；样本孔先加待测样本10 μL，然后加入样本稀释液40 μL。标准品孔和样本孔每孔加入检测抗体100 μL后，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去各孔中液体，加入洗涤液重复洗板5次后，分别加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加入终止液50 μL反应15 min，检测各孔光密度(OD)值。②TET1 mRNA表达：采用RT-PCR法。取肝组织50 mg，TRIzol法提取组织总RNA，将总RNA逆转录为cDNA后，根据M-MLV试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：TET1上游引物：5′-TGGCCAGAAGGGAAAAGCAA-3′，下游引物：5′-TAATCACCCACTTGGCGACC-3′；β-actin上游引物：5′-GTGGACTAGCAAGCAGGAGT-3′，下游引物：5′-CGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。PCR反应条件：42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，退火至4 ℃，-20 ℃保存。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算TET1 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 两组肝损伤情况比较 ①血浆ALT、AST水平：见表1。②肝组织病理变化：灌胃3天，两组肝小叶结构完整，肝细胞形态相似，肝细胞以小叶中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞界限清晰，无炎症改变。灌胃7天，异烟肼组肝小叶周围肝细胞排列紊乱，部分肝细胞肿大；灌胃10天肝细胞肿大更明显，由多角形变为球形，且伴有溶解性坏死；灌胃14天肝细胞胞质呈弥漫性疏松化，气球样；灌胃21天可见肝细胞溶解坏死，出现双核细胞；灌胃28天可见点状坏死灶及纤维组织增生。对照组灌胃7、10、14、21、28天与灌胃3天比较未见明显变化。

表1 两组不同时间血浆ALT、AST水平比较

注：与对照组同期比较，*P<0.05；与同组灌胃3天比较，#P<0.05；与同组灌胃7天比较，△P<0.05；与同组灌胃10天比较，▲P<0.05；与同组灌胃14天比较，▽P<0.05；与同组灌胃21天比较，▼P<0.05。

2.2 两组不同时间肝组织GSTP1基因C、5mC和5hmC相对表达量比较 见表2。

表2 两组不同时间肝组织GSTP1基因C、5mC和5hmC相对表达量比较(%)

注：与对照组同期比较，*P<0.05；与同组灌胃3天比较，#P<0.05；与同组灌胃7天比较，△P<0.05；与同组灌胃10天比较，▲P<0.05；与同组灌胃14天比较，▽P<0.05；与同组灌胃21天比较，▼P<0.05。

2.3 两组不同时间肝组织TET1相对表达量比较 见表3。

3 讨论

DNA甲基化可通过影响染色质的结构与功能，改变相关基因的表达，继而引起某些疾病[9]。

表3 两组不同时间肝组织TET1表达比较

注：与对照组同期比较，*P<0.05；与同组灌胃3天比较，#P<0.05；与同组灌胃7天比较，△P<0.05；与同组灌胃10天比较，▲P<0.05；与同组灌胃14天比较，▽P<0.05；与同组灌胃21天比较，▼P<0.05。

Kovalenko等[10]研究发现，用不同浓度吡嗪酰胺饲养的Wistar大鼠肝组织可出现不同程度损伤，其肝脏全基因组甲基化降低，GSTP1基因启动子区出现超甲基化改变，提示GSTP1基因DNA甲基化可能参与了ADLI的发生、发展。

谷胱甘肽转移酶家族(GSTs)是参与许多药物Ⅱ相代谢所必需的催化酶，在生物解毒过程中发挥重要作用。GSTP1是GSTs的重要一员，存在于其5号外显子区域的突变位点，可使第105位氨基酸由异亮氨酸转变为缬氨酸，这一改变可降低酶的催化活性，继而影响其解毒功能[11]。有研究发现，GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化可抑制其相关蛋白的表达，在肝癌早期即已存在这种改变，并通过这种方式影响肝损伤及肝癌的发生、发展过程[12]。本课题组前期研究发现，GSTP1基因启动子区高甲基化者比低甲基化者发展为ADLI的危险性更高，提示ADLI的发生与GSTP1基因高甲基化表达密切相关[13]。TET1蛋白作为一种羟化酶，能够将5mC催化成5hmC，从而精密地调控基因组甲基化和去甲基化平衡[14]。但5hmC作为去甲基化过程中的关键环节和中间产物，在ADLI发展过程中的研究鲜有报道。

本研究结果显示，异烟肼组随着给药时间的延长，肝损伤程度逐渐加重；其GSTP1基因C含量随着肝损伤程度加重呈下降趋势，而5mC含量先上升，至灌胃14天略有回落，随后继续上升；5hmC含量呈现下降趋势，至灌胃21天降至最低，灌胃28天时略有回升。说明随着肝损伤程度加重，GSTP1基因甲基化水平升高，而羟甲基化水平下降。TET1蛋白是将5mC催化为5hmC的关键蛋白。本研究发现， TET1蛋白及mRNA表达与5hmC的变化趋势基本一致，进一步证实了上述结论。

综上所述， DNA羟甲基化可能参与了ADLI的发生。但本研究观察时间较短，今后研究中需适当延长观察时间，以便进一步明确ADLI与DNA甲基化和羟甲基化的关系。

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冯福民(E-mail: fm_feng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.009

R575.1

A

1002-266X(2017)40-0032-03

2016-09-21)