陶强，郭建荣，金孝岠

(1皖南医学院，安徽芜湖 241001；2第二军医大学附属公利医院)

红细胞微粒及其在机体生理病理过程中作用的研究进展

陶强1,2，郭建荣2，金孝岠1

(1皖南医学院，安徽芜湖 241001；2第二军医大学附属公利医院)

红细胞微粒(RMPs)是一种由红细胞释放的直径0.1～1 μm的磷脂囊泡，具有球形、管形以及大碎片状三种形态，主要由游离Hb、脂质以及参与各种生物学效应的蛋白质组成，氧化应激、内毒素、细胞因子、补体、高剪切力及温度、pH值变化均可导致RMPs形成。RMPs的释放被认为是红细胞摆脱特定的有害物质侵袭并维持稳态的一种方式。RMPs可参与细胞间信息传递、红细胞老化清除、红细胞贮存损伤、凝血及免疫反应等生理病理过程。深入研究RMPs有助于明确体内红细胞衰亡过程、体外贮存损伤过程以及血液制品使用过程中对人体的影响，有助于减少输血风险。

红细胞微粒；贮存损伤；凝血功能

微粒是体内各种细胞包括血小板、红细胞、白细胞、内皮细胞释放的直径0.1～1 μm的磷脂囊泡，其中由红细胞释放的微粒称为红细胞微粒或微泡(RMPs)，活化和衰亡的红细胞均可形成和释放RMPs。一般情况下，红细胞衰亡或受刺激时以出芽的形式从细胞膜上释放RMPs，这个过程被认为是一种对细胞应激的原始应答[1]。RMPs的形成被认为是红细胞摆脱特定有害物质[变性Hb、C5b-9补体复合物、带3蛋白(Band 3)的新抗原、免疫球蛋白G等]的侵袭，并维持组织稳态的一种方式，但是RMPs对机体亦有不利的影响，如促进血栓形成、激活炎症反应等。本文就RMPs的特点及其参与机体生理病理过程的最新研究进展作一综述。

1 RMPs的特点

1.1 RMPs的组成 Arraud等[2]研究表明，RMPs具有球形、管形以及大碎片状三种形态。蛋白质组学分析结果显示，RMPs所含蛋白质与其亲代细胞并不完全相同，RMPs膜表面在保留了红细胞表面蛋白抗原(如血型糖蛋白A)的同时，其骨架相关分子数量相对减少，其他组分如Hb、Band 3、血型糖蛋白、补体受体、糖肌醇磷脂-锚定蛋白和脂筏标记蛋白相对增多，RMPs磷脂酰丝氨酸(PS)和同源IgG6、7、17、19、20亦增多[3]。

RMPs主要由游离Hb、脂质以及参与各种生物学效应的蛋白质组成。一项采用HbA1C作为细胞年龄标记及其获得片段的研究表明，在红细胞的整个生命周期内，RMPs的形成使得循环红细胞失去20% Hb和细胞质膜，说明RMPs中残留的Hb大部分来自于循环红细胞[4]。RMPs中的脂质是以特异性口形脂筏的形式存在。脂筏是指胆固醇和鞘磷脂在真核细胞的质膜表面构成的微小、动态、有序的结构域，能够影响质膜组成、细胞信号转导等重要生物学过程[5]。研究表明，RMPs所含的脂筏主要由红细胞膜整合蛋白构成，并含有大量与钙离子相关的会联蛋白和抗药蛋白[6]。RMPs的磷脂酸含量是完整红细胞的10倍，磷脂酰乙醇胺含量较红细胞稍降低，其余磷脂构成和完整红细胞相似；但由于缺乏血影蛋白，RMPs膜蛋白的磷含量只有完整红细胞的一半[7]。RMPs中血型糖蛋白与胆固醇的含量与完整红细胞胞膜一致，其主要组成蛋白质的含量也与红细胞类似[7]。

1.2 RMPs的形成 已知的一些特殊刺激，包括氧化应激、内毒素、细胞因子、补体、高剪切力等均可以导致RMPs形成[8]。RMPs的形成机制目前主要有两种，一种为钙离子诱导RMPs形成，另一种则与Band 3有关。

当pH为11时，红细胞的双层骨架相互作用减弱，在内外膜之间形成一个不同于内外膜的极端区域，此时RMPs呈游离状态或通过一个狭窄的蒂与母细胞相连接[11]。随着温度升高，红细胞释放的RMPs也逐渐增多。研究表明，45 ℃条件下孵育新鲜人和兔红细胞，并用EDTA和氯化钙滴定，此时红细胞以出芽的形式释放出大小为0～1 nm的无细胞骨架的RMPs[12]。

1.3 RMPs的清除 RMPs的清除机制主要为：①通过与巨噬细胞起源器官的清除受体结合而被清除；②通过衰老的抗原特异性抗体被单核吞噬细胞系统清除[13]。研究发现，肝脏的Kupffer细胞可在5 min内快速清除RMPs[14]；心脏外科手术期间使用血液回收机也可清除RMPs[15]。

1.4 RMPs的检测 目前检测RMPs的技术较多，如流式细胞技术、动态光散射技术、电子显微镜观察、纳米颗粒跟踪分析、酶联免疫吸附试验、蛋白质组学和质谱分析等。由于RMPs通常含有跨膜蛋白，如Band3、血型抗原和血型糖蛋白，因此大多数流式细胞仪能使用针对血型糖蛋白A、CD47或者其他血液类属等特殊抗原的抗体进行检测。张宁洁等[16]研究显示，使用“二次离心”方法和超滤离心管结合可明显提高RMPs的获得率。最近的一项研究证明，二醋酸羧基荧光素琥珀酰亚胺脂与血型糖蛋白A抗原结合可监测和定量分析循环中的RMPs，相比单独的血型糖蛋白A或者膜联蛋白V标记检测，可使检测精确性提高4～7倍[17]。

2 RMPs在机体生理病理过程中的作用

2.1 参与细胞间信息传递 细胞间信息传递主要通过细胞间物质的转移完成。RMPs能介导细胞间生物活性材料的运输和交换，包括转移肽、蛋白质、脂质成分、miRNAs、mRNA和DNA[18]。研究表明，RMPs是控制疟原虫生命周期中阶段转换的一个重要组成部分，疟原虫感染时RMPs的释放和调度对于患者的预后具有重要影响。严重疟疾患者体内高浓度的RMPs对于细胞间通讯是必不可少的，疟原虫可劫持RMPs系统以便进行细胞间的交叉通讯。RMPs已经被确定与疟原虫DNA转录和密度调控有关[19]。在阵发性睡眠性血红蛋白尿患者中，细胞与细胞之间通过RMPs完成两种糖基磷脂酞肌醇锚蛋白、CD55和CD59转移。RMPs在红细胞溶解时可将PS转移到有核细胞的表面，并将其“标记”为假阳性衰亡细胞[20]。由于储血袋里含有很多RMPs，因此输血可能潜在导致输血者CD55和CD59水平升高[21]。

2.2 参与红细胞老化清除 成熟红细胞没有线粒体和细胞核，其在活体内老化的终点是衰亡，这是一种类似于有核细胞程序性死亡的过程。而在红细胞成熟老化及衰亡过程中，其细胞膜会不断形成RMPs。体内的RMPs形成不仅使红细胞膜及Hb随着微泡化的发生而不断丢失，还可自动调节和清除细胞内变性的Hb及其他失去功能的蛋白，使红细胞不会过早被清除。早期随着RMPs的形成及脱落，红细胞体积减小、数量增加，后期老化程度高的红细胞微泡化作用加强，形成的RMPs含有更多Hb，红细胞本身Hb含量下降。不断的微泡化使红细胞的变形能力减弱，细胞膜弹性下降，这种改变是体内红细胞衰亡的主要因素。因此，红细胞释放RMPs受到精细调节，并与衰老红细胞的清除有重要关系。

RMPs可通过调控红细胞表面CD47表达而介导红细胞清除。CD47是一种红细胞膜表面蛋白，巨噬细胞可识别CD47并且不会被激活，当红细胞衰老或损伤使RMPs释放增多，其细胞膜表面CD47表达减少，将会激活巨噬细胞的清除作用[22]。诱导RMPs形成的体外代谢和机械应力可导致细胞膜磷脂不对称性降低，使得PS外化，而外化的PS将作为网状内皮系统中巨噬细胞吞噬红细胞的信号，参与介导巨噬细胞的吞噬作用[23]。

2.3 参与红细胞贮存损伤 体外贮存的红细胞会发生一系列包括生物化学、代谢、形态结构等方面的损伤，称为贮存损伤。研究显示，体外贮存过程中影响微泡释放的因素较多，包括贮存相关红细胞蛋白的分解和氧化应激，细胞新陈代谢(能量损耗)，生物力学性能及钙、神经酰胺、PS暴露水平等。Almizraq等[23]研究发现，浓缩红细胞体外贮存前10天RMPs水平基本不变，第10～15天RMPs水平急速升高，然后一直缓慢升高，5～8周趋于稳定；该研究同时观察到随着红细胞体外贮存时间的延长，RMPs水平及红细胞溶血率均逐渐升高，而ATP、Hb水平及红细胞变形能力均显著下降，红细胞膜磷脂(包括磷脂酰乙醇胺、PS、磷脂酰胆碱)和总脂质含量也逐渐降低。细胞内ATP等能量缺乏可使细胞抗氧化防御能力降低，从而导致细胞贮存损伤，而这些变化可能会引起输血不良反应。因此，明确体外RMPs形成的原因对于当前血液制品的贮存和使用是十分重要的。在小鼠输血模型中，在贮存红细胞中添加抗坏血酸能显著减少RMPs形成[24]，说明添加抗坏血酸(或其他抗氧化剂)可能对于红细胞的储存以及减少输血不良反应具有重要意义。

2.4 参与凝血 RMPs表面PS外翻的暴露可促使凝血酶形成，为凝血反应提供了一个适宜的表面[25]。斯科特综合征是一种罕见的先天性出血性疾病，其原因是血小板和红细胞囊泡形成障碍，不能使PS从膜的内面外翻到膜表面而促进凝血[25]。斯科特综合征说明RMPs的形成能够促进凝血过程，其形成障碍可导致出血的发生。

Rubin等[26]研究表明，RMPs有XI因子依赖的促凝功能，可促进凝血酶的生成而不依赖组织因子。Zecher等[27]也证实，RMPs能诱发补体活化，通过凝血酶依赖机制，而非依赖经典途径、凝集素途径或旁路途径参与凝血过程。一项对镰刀形红细胞贫血病的研究表明，RMPs通过增加患者体内血浆D-二聚体水平而导致血液高凝状态[28]。然而RMPs对于凝血的作用在临床仍是一个有争议的问题。RMPs的促凝作用对于临床手术止血具有重要意义，但部分学者认为血液中过多的RMPs可增加血液高凝状态的风险，也可能会导致不良反应发生率的升高。Koshiar等[25]认为，RMPs可以促进蛋白C系统的抗凝反应，并可能对维持凝血反应和抗凝血作用之间的平衡具有重要作用。

2.5 参与免疫反应 输血可抑制输血者的免疫功能，接受去白细胞的红细胞输血患者可发生明显的输血相关免疫抑制反应。Schifferli等[29]研究证明，RMPs在输血后免疫抑制的发生过程中发挥重要作用。衰老红细胞丧失的红细胞膜补体受体1型分子(CR1)和CD55分子均积聚于RMPs，且RMPs能够结合补体分子C1q，激活C3片段结合的补体经典途径。体外实验结果表明，RMPs能够通过活化酵母多糖A和LPS而显著抑制巨噬细胞表达，并减少TNF-α和IL-8释放，RMPs的这种抑制作用可持续至少24 h，表明RMPs可能参与免疫抑制过程[30]。

综上所述，RMPs可参与细胞间信息传递、红细胞老化清除、红细胞贮存损伤、凝血及免疫反应等生理病理过程。目前对RMPs的研究尚不深入，其生成过程及作用机制也并不完全清楚。深入研究RMPs有助于明确体内红细胞衰亡过程、体外贮存损伤过程以及血液制品使用过程中对人体的影响，对保障输血安全具有重要意义。

[1] Morel O, Morel N, Jesel L, et al. Microparticles: a critical component in the nexus between inflammation, immunity, and thrombosis[J]. Semin Immunopathol, 2011,33(5):469-486.

[2] Arraud N, Linares R, Tan S, et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration[J]. J Thromb Haemost, 2014,12(5):614-27.

[3] Canellini G, Rubin O, Delobel J, et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry[J]. Blood Transfus, 2012,10(Suppl 2):s39.

[4] Willekens FL, Werre JM, Groenen-Döpp YA, et al. Erythrocyte vesiculation: a self-protective mechanism[J]. Br J Haematol, 2008,141(4):549-556.

[5] Kraft ML. Plasma membrane organization and function: moving past lipid rafts[J]. Mol Biol Cell, 2013,24(24): 2765-2768.

[6] Salzer U, Hinterdorfer P, Hunger U, et al. Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific, lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin[J]. Blood, 2002,99(7):2569-2577.

[7] Westerman M, Porter JB. Red blood cell-derived microparticles: an overview[J]. Blood Cells Mol Dis, 2016(59):134-139.

[8] Miyazaki Y, Nomura S, Miyake T, et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles[J]. Blood, 1996,88(9):3456-3464.

[9] Rubin O, Canellini G, Delobel J, et al. Red blood cell microparticles: clinical relevance[J]. Transfus Med Hemother, 2012,39(5):342-347.

[10] Bosman GJ, Lasonder E, Groenendöpp YA, et al. The proteome of erythrocyte-derived microparticles from plasma: new clues for erythrocyte aging and vesiculation[J]. J Proteomics, 2012(76):203-210.

[11] Iglic A, Hägerstrand H, Kralj-Iglic V, et al. A possible physical mechanism of red blood cell vesiculation obtained by incubation at high pH[J]. J Biomech, 1998,31(2):151-156.

[12] Moore T, Sorokulova I, Pustovyy O, et al. Microscopic evaluation of vesicles shed by erythrocytes at elevated temperatures[J]. Microsc Res Tech, 2013,38(11):487-492.

[13] Willekens FL, Werre JM, Groenen-Döpp YA, et al. Erythrocyte vesiculation: a self-protective mechanism[J]. Br J Haematol, 2008,141(4):549-556.

[14] Willekens FL, Werre JM, Kruijt JK, et al. Liver Kupffer cells rapidly remove red blood cell-derived vesicles from the circulation by scavenger receptors[J]. Blood, 2005,105(5):2141-2145.

[15] van den Goor JM, Nieuwland R, Van OW, et al. Cell Saver device efficiently removes cell-derived microparticles during cardiac surgery[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2007,134(3):798-799.

[16] 张宁洁,卜艳红,王勇军.红细胞血液制品中红细胞微粒检测方法的建立[J].中国输血杂志,2015,28(10):1218-1221.

[17] Grisendi G, Finetti E, Manganaro D, et al. Detection of microparticles from human red blood cells by multiparametric flow cytometry[J]. Blood Transfus, 2015,13(2):274-280.

[18] Barteneva NS, Fasler-Kan E, Bernimoulin M, et al. Circulating microparticles: square the circle[J]. BMC Cell Biol, 2013,14(1):1-21.

[19] Mantel PY, Hoang AN, Goldowitz I, et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system[J]. Cell Host Microbe, 2013,13(5):521-534.

[20] Sloand EM, Mainwaring L, Keyvanfar K, et al. Transfer of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins to deficient cells after erythrocyte transfusion in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria[J]. Blood, 2004,104(12):3782-3788.

[21] Liu R, Klich I, Ratajczak J, et al. Erythrocyte-derived microvesicles may transfer phosphatidylserine to the surface of nucleated cells and falsely ′mark′ them as apoptotic[J]. Eur J Haematol, 2009,83(3):220-229.

[22] Stewart A, Urbaniak S, Turner M, et al. The application of a new quantitative assay for the monitoring of integrin-associated protein CD47 on red blood cells during storage and comparison with the expression of CD47 and phosphatidylserine with flow cytometry[J]. Transfusion, 2005,45(9):1496-1503.

[23] Almizraq R, Tchir JD, Holovati JL, et al. Storage of red blood cells affects membrane composition, microvesiculation, and in vitro quality[J]. Transfusion, 2013,53(10):2258-2267.

[24] Stowell SR, Smith NH, Zimring JC, et al. Addition of ascorbic acid solution to stored murine red blood cells increases posttransfusion recovery and decreases microparticles and alloimmunization[J]. Transfusion, 2013,53(10):2248-2257.

[25] Koshiar RL, Somajo S, Norström E, et al. Erythrocyte-derived microparticles supporting activated protein c-mediated regulation of blood coagulation[J]. PLoS One, 2014,9(8):e104200.

[26] Rubin O, Delobel J, Prudent M, et al. Red blood cell-derived microparticles isolated from blood units initiate and propagate thrombin generation[J]. Transfusion, 2013,53(8):1744-1754.

[27] Zecher D, Cumpelik A, Schifferli JA. Erythrocyte-derived microvesicles amplify systemic inflammation by thrombin-dependent activation of complement[J]. Arterioscler Thromb Vas Biol, 2014,34(2):313-320.

[28] Zayed RA, El-Ghamrawi M, Alwakeel HA, et al. Impact of circulating erythrocyte-derived microparticles on coagulation activation in sickle cell disease[J]. Comparat Clin Pathol, 2015,24(5):1123-1128.

[29] Sadallah S, Eken C, Schifferli JA. Ectosomes as modulators of inflammation and immunity[J]. Clin Exp Immunol, 2011,163(1):26-32.

[30] Sadallah S, Eken C, Schifferli JA. Erythrocyte-derived ectosomes have immunosuppressive properties[J]. J Leukocyte Biol, 2008,84(5):1316-1325.

国家自然科学基金资助项目(81671919)；上海市卫生和计划生育委员会科研项目(201440456)；上海市浦东新区科技发展基金项目(PKJ2012-Y54)；上海市浦东新区卫生系统重点学科群建设项目(PWZxq2017-10)。

郭建荣(E-mail： jianrguo@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.035

R446.11

A

1002-266X(2017)40-0104-04

2016-11-29)