张扬武，罗伟生，康毅，禤传凤，王仕衍，张夏，陈姗，蔡碧莲

(1广西国际壮医医院，南宁530001；2广西中医药大学；3广西中医药大学第一附属医院)

·基础研究·

荔枝核总黄酮对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及PPAR-γ、TGF-β1表达的影响

张扬武1，罗伟生2，康毅3，禤传凤2，王仕衍2，张夏2，陈姗2，蔡碧莲2

(1广西国际壮医医院，南宁530001；2广西中医药大学；3广西中医药大学第一附属医院)

目的探讨荔枝核总黄酮(TFL)对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响及其机制，为肝纤维化的临床治疗提供依据。方法将体外培养的HSC-T6细胞分为观察1、2、3组和对照组。观察1组加640 μg/mL的TFL，观察2组加640 μg/mL的TFL和15 μmol/L的罗格列酮，观察3组加640 μg/mL的TFL和2 μmol/L的GW9662，对照组加正常培养基。各组均继续培养72 h。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况(结果以OD450值表示)；采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞PPAR-γ、TGF-β1mRNA相对表达量；采用免疫组化SP法检测各组细胞PPAR-γ、TGF-β1蛋白阳性表达率。结果培养72 h观察1、2、3组OD450值均低于对照组(P均<0.05)，观察2组OD450值低于观察1组(P<0.05)，观察3组OD450值高于观察1组(P<0.05)。观察1、2、3组PPAR-γ mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率均高于对照组(P均<0.05)；TGF-β1mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率均低于对照组(P均<0.05)；观察2组PPAR-γ mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率高于观察1组(P<0.05)，TGF-β1mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率低于观察1组(P<0.05)；观察3组PPAR-γ mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率低于观察1组(P<0.05)，TGF-β1mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率高于观察1组(P<0.05)。结论TFL能够抑制大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖，该作用可能与其上调PPAR-γ表达、下调TGF-β1表达有关。

肝纤维化；荔枝核总黄酮；肝星状细胞；过氧化物酶体增殖物激活受体γ；转化生长因子β1；大鼠

荔枝核味甘、微苦，归肝肾两经，具有祛寒止痛、行气散结的功效，荔枝核总黄酮(TFL)是荔枝核中药理活性的主要成分之一。近年研究表明，TFL具有明显的抗肝纤维化作用；TFL能够上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、下调结缔组织生长因子的表达，逆转肝纤维化[1]；TFL可通过上调PPAR-γ/c-Ski、下调α激动蛋白抑制肝星状细胞的活化[2]。但其对PPAR-γ/TGF-β1信号通路有无交叉影响尚未可知。2016年1月～2017年2月，我们观察了TFL对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及PPAR-γ、TGF-β1表达的影响，现分析结果并探讨其机制，旨在为肝纤维化的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 HSC-T6细胞购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。TFL购自南京泽郎医药科技有限公司，纯度85%；罗格列酮、GW9662购自购自上海皓元生物医药科技有限公司；FBS、DMEM高糖培养基购自加拿大维森特公司；CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、PPAR-γ、TGF-β1、GAPDH内参引物购自宝生物工程(大连)有限公司;PPAR-γ、TGF-β1一抗购自美国Abcam公司；兔免疫组化SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞分组及干预 电子天平秤称量20 mg TFL溶解于125 μL的DMSO中，加入完全培养基至25 mL，过滤配制成800 μg/mL的母液，然后用完全培养基稀释成640 μg/mL的工作液[1]；用文献[3，4]的方法制作罗格列酮工作液(浓度15 μmol/L)和GW9662工作液(浓度2 μmol/L)。取处于对数生长期的 HSC-T6细胞，胰酶消化后进行细胞计数，调整细胞密度为2×104/mL ,吹悬打匀后以每孔100 μL接种于96孔培养板。设观察1、2、3组和对照组，每组5孔。细胞完全贴壁后弃去旧培养基，观察1组加640 μg/mL的TFL，观察2组加640 μg/mL的TFL和15 μmol/L的罗格列酮，观察3组加640 μg/mL的TFL和2 μmol/L的GW9662，对照组加正常培养基。继续培养72 h。

1.3 相关指标观察

1.3.1 组细胞增殖情况 采用CCK-8法。各组细胞培养72 h后弃培养基，加入新的完全培养基后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃培养箱孵育1 h，多功能酶标读数仪上测定450 nm处的OD值(OD450值)。

1.3.2 PPAR-γ、TGF-β1mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法。培养72 h后用TRIzol法提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA，用SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书行实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参照。GAPDH上游引物5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，下游引物5′-GTGGTTCACACCCATCACAA-3′；PPAR-γ上游引物5′-CTGTTTTATGCTGTTATGGGT-3′，下游引物5′-GTCAAAGGAA-TGGGAGTGGTC-3′；TGF-β1上游引物5′-CTGGGGCCCTGCCCCTACAT-3′，下游引物5′-CTTGGGCTTGCG-ACCCACGT-3′。采用美国ABI 7300 PCR仪进行扩增，两步法反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，44个循环。读取Ct值，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

1.3.3 PPAR-γ、TGF-β1蛋白表达 采用免疫组化SP 法。培养72 h 后取各组细胞用4%多聚甲醛固定，3% H2O2消除内源性过氧化氢酶，正常血清封闭后分别加入鼠抗人PPAR-γ、TGF-β1单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，随后加入生物素二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液，经DAB 显色，脱水、封片，光学显微镜下观察。每组随机选取9个有意义的高倍镜视野进行观察，可见细胞质呈特异性棕褐色阳性染色，计算每个视野下细胞中阳性细胞所占的百分数，即阳性表达率。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况比较 培养72 h时观察1、2、3组和对照组OD450值分别为1.534± 0.016、1.318±0.006、1.846±0.017、2.244±0.084。观察1、2、3组OD450值均低于对照组(P均<0.05)，观察2组OD450值低于观察1组(P<0.05)，观察3组OD450值高于观察1组(P<0.05)。

2.2 各组PPAR-γ、TGF-β1mRNA相对表达量比较 观察1、2、3组PPAR-γ mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.05)，TGF-β1mRNA相对表达量均低于对照组(P均<0.05)。观察2组PPAR-γ mRNA相对表达量高于观察1组(P<0.05)，TGF-β1mRNA相对表达量低于观察1组(P<0.05)。观察3组PPAR-γ mRNA相对表达量低于观察1组(P<0.05)，TGF-β1mRNA相对表达量高于观察1组(P<0.05)。见表1。

2.3 各组PPAR-γ、TGF-β1蛋白阳性表达率比较 观察1、2、3组PPAR-γ蛋白阳性表达率均高于对照组(P均<0.05)，TGF-β1蛋白阳性表达率均低于对照组(P均<0.05)。观察2组PPAR-γ蛋白阳性表达率高于观察1组(P<0.05)，TGF-β1蛋白阳性表达率低于观察1组(P<0.05)。观察3组PPAR-γ蛋白阳性表达率低于观察1组(P<0.05)，TGF-β1蛋白阳性表达率高于观察1组(P<0.05)。见表1。

表1 培养72 h后各组PPAR-γ、TGF-β1 mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与观察1组比较，#P<0.05。

3 讨论

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病转化成肝硬化的必经阶段。逆转肝纤维化是阻断肝脏疾病转化成肝硬化的惟一方法[5]。肝纤维化的形成是由于肝星状细胞(HSC)的激活从而导致大量的细胞外基质(ECM)沉积于肝内，而HSC激活的同时又可分泌大量的TGF-β1，这种自分泌的正反馈机制使TGF-β1加强储脂细胞合成胶原，促进大量ECM合成，从而促进肝纤维化不断进展[6]。研究证实，PPAR-γ通路可抑制HSC的活化而延缓肝纤维化进程；PPAR-γ可能是一种新的治疗纤维化疾病的药理学靶点[7]。PPAR-γ活性降低与HSC纤维母细胞样活化关系密切，而给予活化的HSC多种内源或外源性PPAR-γ配体可显著抑制HSC纤维生成活性[8]；PPAR-γ可通过阻断TGF-β1信号通路抑制ECM的生成，从而抑制肝星状细胞的活化和增殖[9]。PPAR-γ/TGF-β-Smad信号通路共同介导肝纤维化，姜黄素通过减少PPAR-γ的表达，从而减少ECM产生，PPAR-γ基因启动子内有两个Smad结合元件(SBEs)，Smad3/4蛋白复合物可特异性结合至SBEs，Smad4过度表达可消除姜黄素对PPAR-γ启动子的负调节作用，减弱其对TGF-β信号通路的抑制作用[10]。

PPAR-γ作为一种核转录因子，对细胞的活化和增殖具有重要的调节作用。罗格列酮除了具有降糖作用外，还可以作为PPAR-γ的激动剂。研究发现，罗格列酮能够通过上调PPAR-γ的表达从而抑制Ⅰ型胶原的表达，实现肝纤维化的逆转[11]；罗格列酮干预后大鼠的肝纤维化程度减轻，PPAR-γ信号通路的变化与TGF-β1的表达存在某种关联，PPAR-γ信号的激活可能通过TGF-β1途径调节肝纤维化的进程[12]。GW9662是PPAR-γ选择性不可逆拮抗剂。当罗格列酮激动PPAR-γ的表达时，HSC细胞的活化和增殖受到抑制，采用GW9662干预后，其PPAR-γ的表达受到抑制，抑制肝纤维化的作用减弱，从而证明GW9662可作为罗格列酮激动PPAR-γ表达的特异性阻断剂[13～15]。

TFL是从荔枝核提取出来的一种化合物。研究证实，TFL有明显的抗肝纤维化作用，涉及参与的信号通路主要有PPAR-γ、TGF-1、核转录因子-κB(NF-κB)、Toll样受体(TLR)、血小板衍生生长因子(PDGF)等[1，2，16，17]。肝纤维化进程不是单一信号通路作用的结果，其中存在多个途径的相互交叉和叠加，这一过程非常复杂。本研究结果显示，TFL能抑制HSC-T6细胞的增殖，加入罗格列酮则HSC-T6细胞增殖活性进一步下降，加入GW9662则HSC-T6细胞增殖活性有所恢复。应用TFL联合罗格列酮的观察2组PPAR-γ mRNA相对表达量及蛋白阳性表达率高于单纯应用TFL的观察1组，TGF-1 mRNA相对表达量及蛋白阳性表达率低于单纯应用TFL的观察1组；而应用TFL联合GW9662的观察3组PPAR-γ mRNA相对表达量及蛋白阳性表达率低于单纯应用TFL的观察1组，TGF-1 mRNA相对表达量及蛋白阳性表达率高于单纯应用TFL的观察1组。提示TFL抑制HSC-T6细胞增殖的作用可能是通过上调PPAR-γ表达、下调TGF-1表达而实现的。激活PPAR-γ信号通路、进而抑制TGF-1表达可以抑制肝星状细胞HSC-T6细胞的增殖，可能有助于逆转肝纤维化。

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国家自然科学基金资助项目(81360530，81660779)；广西中医药大学硕士研究生科研创新重点项目(YJS201617)。

罗伟生(E-mail: 4011188@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.008

R575

A

1002-266X(2017)40-0029-03

2016-10-27)