孙为增，林国雄，林海

(海南省人民医院，海口570311)

沉默钙连蛋白对人肾母细胞瘤细胞凋亡及内质网应激、JNK信号通路的影响

孙为增，林国雄，林海

(海南省人民医院，海口570311)

目的探讨沉默钙连蛋白(Calnexin)对肾母细胞瘤细胞凋亡及内质网应激、JNK信号通路的影响。方法将肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞分为对照组、空载体组、实验组。对照组正常培养不转染。空载体组转染空白质粒，实验组转染Calnexin shRNA。转染24 h后全部更换为正常培养液继续培养48 h。采用实时荧光定量 PCR法检测各组Calnexin mRNA表达，TUNEL法检测细胞凋亡指数(AI)，Western blotting法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、需肌醇酶1(IRE1)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、凋亡信号调节激酶1(ASK1)、磷酸化凋亡信号调节激酶1(p-ASK1)、c-Jun N末端激酶(JNK)及磷酸化c-Jun N末端激酶(p-JNK)蛋白相对表达量。结果Calnexin mRNA相对表达量：实验组、空载体组、对照组分别为0.28±0.01、1.01±0.06、1.00±0.08；实验组低于空载体组和对照组(P<0.05)，但空载体组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。AI：实验组、空载体组、对照组分别为32.86±3.72、5.46±0.68、5.26±0.17；实验组高于空载体组和对照组(P<0.05)，但空载体组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白相对表达量：实验组高于空载体组和对照组(P均<0.05)，但空载体组与对照组比较无统计学差异(P均>0.05)。结论沉默Calnexin 可引发内质网应激并激活JNK细胞凋亡通路，进而促进肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞凋亡。

肾母细胞瘤；钙连蛋白；细胞凋亡；内质网应激；JNK信号通路

肾母细胞瘤占我国小儿恶性肿瘤的17.8%左右，目前主要采用手术+放化疗等综合疗法治疗，但Ⅲ、Ⅳ期肾母细胞瘤治疗效果及预后不佳[1，2]。在肿瘤的发生及发展过程中，内质网应激(ERS)普遍存在[3]，且ERS可选择性的保留对ERS有拮抗倾向的细胞，使存活下的肿瘤细胞向更恶性的方向进展[4]。钙连蛋白(Calnexin)是内质网中的Ⅰ型跨膜蛋白，具有辅助糖蛋白折叠装配、控制内质网折叠蛋白质量监控、调节细胞内Ca2+稳态和缓解ERS等作用[2]。本课题组提出下调Calnexin基因表达可使肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞无法调节及降解错误折叠蛋白，进而促进肿瘤细胞凋亡的科学假说。为验证这一假说，2016年6～10月，我们用慢病毒转染技术沉默肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞Calnexin mRNA表达，并观察了SK-NEP-1细胞ERS情况及下游JNK通路蛋白表达情况的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SK-NEP-1细胞购自美国ATCC公司，用含有10%灭活胎牛血清的DMEM培养液于37 ℃、5%CO2、饱和湿度下培养，每2至3天传代1次。钙连蛋白短发夹RNA(Calnexin shRNA)为本实验室自行制备。实时荧光定量PCR试剂盒及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、需肌醇酶1(IRE1)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、凋亡信号调节激酶1(ASK1)、磷酸化凋亡信号调节激酶1(p-ASK1)、c-Jun N末端激酶(JNK)及磷酸化c-Jun N末端激酶(p-JNK)蛋白检测试剂盒购自Boster公司。

1.2 SK-NEP-1细胞分组及Calnexin shRNA转染 将SK-NEP-1细胞悬浊液以5×104/孔的密度接种于24孔板，细胞融合80%～90%时将细胞分为对照组、空载体组、实验组。对照组正常培养不转染。空载体组转染空白质粒，实验组转染Calnexin shRNA。每组6孔。转染24 h后全部更换为正常培养液继续培养48 h[5]。

1.3 相关指标观察

1.3.1 Calnexin mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法检测，操作按试剂盒说明书进行。正向引物：5′-GAAGGGAAGTGGTTGCTGTG-3′，反向引物：5′-CGTCTTTCTTGGCTTTGGAT-3′。提取各组细胞全部RNA，反转录得到对应的cDNA。在冰浴的无核酸酶的离心管中加入反应混合物，加热条件：70 ℃加热5 min，冷却2 min。离心后加入5×Buffer(4 μL)、RNasin(0.5 μL)、1 μL M-MLV，轻轻混匀。25 ℃温浴10 min，42 ℃温浴50 min，95 ℃加热5 min，终止反应。经由PCR仪完成上述过程，可得20 μL cDNA，待PCR循环结束后，马上升温至95 ℃，维持10 min，再降至60 ℃，维持20 s；提升至72 ℃，维持30 s，最后降至4 ℃维持5 min，此过程循环40次。采用2-ΔΔCT法计算Calnexin mRNA的相对表达量。

1.3.2 细胞凋亡情况 采用TUNEL法检测各组细胞凋亡指数(AI)。收集各组细胞经过0.1%Trition X-100透化后，用PBS漂洗3次，每次漂洗5 min，再滴加3%H2O2200 μL，漂洗3次后，加入蛋白酶K工作液置于常温下20 min；漂洗3次后加入TUNEL反应液(TdT+荧光素标记的dUTP)37 ℃恒温箱中避光孵育60 min；PBS清洗3次后加入DAPI，再次应用PBS漂洗3次，最后防荧光淬灭封片剂封片。随机移动组织切片，选取细胞分布较均匀的高倍视野计数1 000 个以上，在相邻的10个视野下，蓝色荧光为肾母细胞瘤细胞核，绿色荧光为凋亡细胞核。凋亡指数(AI)=各视野阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%。

1.3.3 GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白表达 采用Western blotting法。于液氮条件下研碎细胞，提取细胞内蛋白质并定量检测。于浓缩胶5%、分离胶10%条件下行SDS-PAGE。电泳结束后恒流200 mA转膜90min转印至PVDF膜。P封闭1 h后孵育一抗。加入山羊抗大鼠多克隆HRP标记二抗(1∶1 000)孵育2 h。经ECL底物发光反应后图像保存。普通抗体的封闭液、一抗孵育液、二抗孵育液为5%脱脂奶粉溶液[7]。各目的蛋白相对表达量用目的蛋白条带灰度值与内参照GAPDH条带灰度值之比表示。

2 结果

2.1 各组Calnexin mRNA相对表达量比较 实验组、空载体组、对照组Calnexin mRNA相对表达量分别为0.28±0.01、1.01±0.06、1.00±0.08；实验组Calnexin mRNA相对表达量低于空载体组和对照组(P<0.05)，但空载体组和对照组比较无统计学差异(P>0.05)。

2.2 各组细胞AI比较 实验组、空载体组、对照组AI分别为32.86±3.72、5.46±0.68、5.26±0.17；实验组AI高于空载体组和对照组(P<0.05)，空载体组与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。

2.3 各组GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白相对表达量比较 实验组GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK蛋白相对表达量高于空载体组和对照组(P均<0.05)，但空载体组与对照组比较无统计学差异(P均>0.05)。见表1。

表1 各组GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK和p-JNK相对表达量比较

注：与对照组和空质粒组比较，*P<0.05。

3 讨论

肾母细胞瘤是最早发现对化疗药物敏感的儿童恶性肿瘤，目前采用放疗、化疗及手术等综合治疗方案已将患儿生存率由30%提升至90%以上[8，9]，但放、化疗对患儿产生的长期影响尚无研究报告。寻找高效、靶向治疗肾母细胞瘤的治疗方法是目前研究热点，更是亟待解决的问题。ERS是近年来新发现的指标凋亡机制，现阶段研究认为ERS发生的主要原因是内质网折叠蛋白功能异常，导致错误蛋白在内质网内堆积[5]，短时间的ERS是细胞自我修复的一种方法，但长期ERS发生即可引起细胞凋亡。

Calnexin/钙网织蛋白(Calreticulin)循环是内质网内稳态体系的重要组成部分，对错误折叠的糖蛋白重新折叠起关键作用，而难以纠正构象的糖蛋白为避免在内质网过度堆积造成危害，则在内质网甘露糖苷酶Ⅰ作用下从Calnexin/Calreticulin循环中释放出来，与受体蛋白EDEM结合；后者通过Sec61p通道进入细胞质，在泛素-蛋白酶体系中将其降解，这一过程称为糖蛋白内质网相关性降解[10]。研究证实，恶性肿瘤细胞已耐受缺氧所引发的ERS，减少肿瘤细胞对ERS的耐受性，使肿瘤细胞更倾向于凋亡，可能成为治疗肾母细胞瘤的新靶点[11，12]。JNK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶家族中重要的通路之一，存在于多种生命活动过程中且易受多种细胞外应激因素激活并介导细胞凋亡。已有证据表明，JNK信号通路参与了过度ERS所引发的细胞凋亡[13，14]。因此，沉默Calnexin可能引发SK-NEP-1细胞加重ERS，打破内质网耐受平衡，进而激活JNK信号通路，介导SK-NEP-1细胞凋亡。

本研究用Calnexin shRNA沉默Calnexin基因表达，结果显示转染后实验组细胞Calnexin mRNA相对表达量明显降低，验证了沉默效果。用TUNEL法观察各组细胞凋亡情况，结果实验组细胞凋亡明显增多，与本研究团队提出的假说相符，也与Ryan的研究结果相似[15]。为探讨沉默Calnexin诱导SK-NEP-1细胞凋亡的机制，本研究进一步采用Western blotting法检测各组细胞中ERS标志物GRP78及JNK信号通路相关蛋白RE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK、p-JNK表达，结果显示，沉默Calnexin的实验组细胞GRP78、IRE1、TRAF2、ASK1、p-ASK1、JNK及p-JNK表达升高，这说明沉默Calnexin可使细胞内ERS标志物GRP78表达增高，并激活JNK信号通路的表达，打破肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞原本对ERS耐受的平衡，增加JNK信号通路的活化及磷酸化水平，诱导肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞凋亡。进一步验证了本研究团队提出的假说。

综上所述，本研究虽然证实沉默Calnexin可通过 IRE1/TRAF2/ASK1/p-ASK1/JNK/ p-JNK信号通路诱导肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞凋亡。但ERS所引发的信号通路较多[16]，沉默Calnexin对SK-NEP-1细胞其他凋亡通路的影响尚不得而知。下一步的研究将更深入的探讨Calnexin和肾母细胞瘤的关系，为肾母细胞瘤的临床治疗提供新靶点和新思路。

[1] 蒋也平，沈颖，孙宁.174例肾母细胞瘤临床特点及生存分析[J].首都医科大学学报，2009，30(2)：137-141.

[2] 张峰.内质网分子伴侣Calnexin的研究进展[J].生物学通报，2008，43(8)：7-10.

[3] 贾宇鹏，何苗，魏敏杰.GRP78在肿瘤发生发展及干性形成中的研究进展[J].生命的化学，2015，35(4)：559-564.

[4] 曾惠爱，刘先领.内质网应激与肿瘤细胞凋亡[J].肿瘤防治研究，2013，40(2)：206-208.

[5] 王伊林，赵雅君，杨洋，等.磷酸肌酸钠对慢病毒介导Calumenin蛋白沉默阿霉素损伤心肌细胞内质网应激信号通路的作用[J].临床心血管病杂志，2015，31(10)：1119-1122.

[6] Kim SH, Kim KY, Yu SN, et al. Silibinin induces mitochondrial NOX4-mediated endoplasmic reticulum stress response and its subsequent apoptosis[J]. BMC Cancer, 2016,16(1):452.

[7] 王伊林，单晓彤，柴花，等.丹参酮ⅡA磺酸钠腹腔注射对阿霉素心肌病大鼠心功能及左室纤维化的影响[J].山东医药，2016，56(7)：34-36.

[8] Green DM, Breslow NE, Beckwith JB, et al. Treatment with nephrectomy only for small, stage I/favorable histology Wilms′tumor: a report from the National Wilms′Tumor Study Group[J]. J Clin Oncol, 2001,19(17):3719-3724.

[9] 何珂骏，张勤，袁晓军，等.61例儿童肾母细胞瘤的诊断治疗与随访[J].上海交通大学学报(医学版)，2014，34(6)：890-893.

[10] 林胜利，李载权，唐朝枢.Calnexin/Calreticulin循环与糖蛋白内质网应激相关性降解[J].医学分子生物学杂志，2004，1(5):298-301.

[11] 叶建新，刘声源，庄金福.新辅助化疗对进展期胃癌手术并发症的影响[J].肿瘤防治研究，2014，41(9)：1026-1030.

[12] Ghadban T, Jessen A, Reeh M, et al. In vitro study comparing the efficacy of the water-soluble HSP90 inhibitors, 17-AEPGA and 17-DMAG, with that of the nonwater-soluble HSP90 inhibitor, 17-AAG, in breast cancer cell lines[J]. Int J Mol Med, 2016,38(4)：1296-1302.

[13] 赵珊，马迎春，刘亚坤，等.姜黄素通过抑制内质网应激和JNK通路过度活化减轻小鼠肺缺血再灌注损伤[J].中国病理生理学，2013，29(2)：308-313.

[14] 孔宏亮，苗志林，李占全，等.阿霉素对心肌肌醇依赖酶I-JNK通路的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22(1)：66-70.

[15] Ryan D, Carberry S, Murphy AC, et al. Calnexin, an ER-induced protein, is a prognostic marker and potential therapeutic target in colorectal cancer[J]. J Transl Med, 2016,14(1):196.

[16] Zhou XM , Qing X, Wang YL, et al. Total flavonoids of astragalus play a cardioprotective role in viral myocarditis[J]. Acta Cardiol Sin, 2016,32(1):81-88.

Effectsofsilencingcalnexinonapoptosis,endoplasmicreticulumstress,andJNKsignalingpathwayofhumannephroblastomacells

SUNWeizeng,LINGuoxiong,LINHai

(HainanProvincialPeople′sHospital,Haikou570311,China)

ObjectiveTo investigate the effects of silencing calnexin on the apoptosis, endoplasmic reticulum stress, and JNK signaling pathway of human nephroblastoma cells.MethodsThe nephroblastoma SK-NEP-1 cells were divided into the control group, empty vector group, and experimental group. The cells in the control group were not transfected. The cells in the empty vector group were transfected with the blank plasmid, and the experimental group with Calnexin shRNA. After 24-hour transfection, all were replaced with normal culture medium and then were cultured for 48 h. The expression of Calnexin mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The apoptotic index (AI) was detected by TUNEL method. Western blotting was used to detect the relative expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78), inositol-requiring enzyme 1 (IRE1), tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 (TRAF2), apoptosis signal-regulating kinase 1 (ASK1), p-ASK1, c-Jun N-terminal kinase (JNK) and phosphorylated c-Jun N-terminal kinase (p-JNK) protein.ResultsThe relative expression of calnexin mRNA was 0.28±0.01, 1.01±0.06, and 1.00±0.08 in the experimental group, empty vector group, and control group, respectively. The experimental group was lower than the empty vector group and the control group (P<0.05), but there was no significant difference between the empty vector group and the control group (P>0.05). AI in the experimental group, empty vector group, and control group were 32.86±3.72, 5.46±0.68, and 5.26±0.17; the experimental group was higher than the empty vector group and the control group (P<0.05), but there was no significant difference between the empty vector group and the control group (P>0.05). The relative expression levels of GRP78, IRE1, TRAF2, ASK1, p-ASK1, JNK and p-JNK were higher in the experimental group than those in the empty vector group and the control group (allP<0.05), but there was no significant difference between the empty vector group and the control group (P>0.05).ConclusionSilencing calnexin can lead to endoplasmic reticulum stress and activate JNK cell apoptosis pathway, and thus promote the apoptosis of nephroblastoma SK-NEP-1 cells.

nephroblastoma; calnexin; apoptosis; endoplasmic reticulum stress; JNK signaling pathway

海南省自然科学基金资助项目(20168283)。

孙为增(1982-)，男，硕士，主治医师，主要研究方向：小儿外科常见疾病的发病机制及治疗。E-mail： HNsunweizeng@163.com

林海(1978-)，男，硕士，副主任医师，主要研究方向：肾母细胞瘤的治疗。E-mail： linhai2317@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.006

R737.11

A

1002-266X(2017)40-0022-04

2016-11-01)