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(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

茶多酚-肉桂精油复合保鲜剂抗氧化活性及抑菌作用

余小亮,陈舜胜*,贠三月,刘富康,宋玲玲

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

为了研究茶多酚-肉桂精油复合保鲜剂抗氧化活性和对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。采用体外抗氧化法测定了复合保鲜剂抗氧化能力。通过抑菌圈大小确定抑菌效果和最小抑菌浓度(MIC),结合抑菌活力、细菌生长曲线、细胞壁完整性和细胞膜通透性,综合评价复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的影响。结果表明,复合保鲜剂清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的IC50分别为4.02 μg/mL、9.15 μg/mL、0.61 mg/mL。复合保鲜剂能够有效抑制金黄色葡萄球菌的生长,MIC为0.5 mg/mL,且能够破坏细胞壁和细胞膜。综上所述复合保鲜剂具有很强的抗氧化活性,对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌效果,其可能的抑菌机理是破坏细胞壁,影响细胞膜的通透性。

茶多酚,肉桂精油,复合保鲜剂,金黄色葡萄球菌,抗氧化,抑菌

茶多酚是一种抗氧化活性很强的物质,其羟基上的活泼氢离子可以结合自由基,与金属离子螯合,抑制脂质过氧化,增强抗氧化酶活性[1]。目前茶多酚的抑菌机理并未十分明确,其可能的抑菌机理有以下几点:破坏细菌的细胞壁和细胞膜;作用于DNA或RNA;作用于细胞内酶类或功能性蛋白质[2-4]。肉桂精油由于其抗氧化组分能够释放出自身的氢,与外界自由基形成稳定化合物而具有很强的抗氧化活性[5-6]。肉桂精油对李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等有明显的抑菌活性,但是其抑菌机理并没有被明确阐述[7-8]。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是导致细菌性食物中毒的主要病原菌之一[9],隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus),是典型的革兰氏阳性菌。其广泛存在于自然界中,因此,食品受到金黄色葡萄球菌的污染几率特别大,金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌,能产生毒素,对肠道破坏性极大。同时金黄色葡萄球菌也是很多水产品优势腐败菌的一种[10],影响水产品的货架期,因此如何抑制其生长繁殖产生毒素是一个重要的课题。

茶多酚具有很强的抗氧化活性,而其抑菌性稍差,肉桂精油抑菌性强,但抗氧化性较差,目前单一保鲜剂在使用过程中不能达到理想的效果,因此将两者保鲜剂进行复配。在预实验基础上,本研究测定了不同浓度茶多酚-肉桂精油复合保鲜剂(1∶1配比)的抗氧化活性和抑菌效果并且综合阐释了复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机理。本研究为接下来更进一步开发水产品新型保鲜剂，为提高水产品质量安全提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

金黄色葡萄球菌 由本课题组成员前期筛选等到;茶多酚、肉桂精油、乙醇、DPPH、结晶紫、邻苯三酚、维生素C、过氧化氢、氯化钠等 均为分析纯,高信化玻仪器有限公司;胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)、平板计数琼脂 生工生物工程有限公司;碱性磷酸酶(AKP)试剂盒 南京建成科技有限公司。

SG3电导率仪 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UV-3000 PC型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;stat fax-3200酶标仪 美国Awareness公司;Z36HK大容量高速冷冻离心机 德国哈默公司。

1.2复合保鲜剂的配制

结合预实验结果,从抗氧化结果上来看,茶多酚较肉桂精油效果好,但是二者相差并不是特别大,而肉桂精油抑菌能力比茶多酚强(预实验做过抑菌圈实验证实),综合考虑选用茶多酚与肉桂精油按1∶1配比得到茶多酚-肉桂精油复合保鲜剂。

1.3抗氧化能力测定

1.3.1 复合保鲜剂对DPPH自由基清除能力测定 DPPH自由基清除能力测定参照朱培蕾[11]的方法。用无水乙醇配制浓度为2、4、6、8、10 μg/mL的复合保鲜剂五份,精确吸取不同浓度复合保鲜剂4 mL于试管中,再加4 mL、0.1 mmol/L的DPPH溶液,摇匀后在暗处反应30 min,分别测定517 nm处的吸光值Ai;以4 mL无水乙醇代替DPPH溶液再加入上述溶液4 mL,测吸光值Aj。以4 mL无水乙醇替代复合保鲜剂,再加入4 mL DPPH溶液作为空白组,测吸光值A0，清除率公式如下所示。单独使用1、2、3、4、5 μg/mL的茶多酚、肉桂精油二者清除率相加做对照,每组均重复测三次。

1.3.2 复合保鲜剂对羟基自由基清除能力测定 采用结晶紫法[12]测定保鲜剂对羟基自由基清除效果。具体操作:取若干试管,各加入1.5 mL 0.4 mmol/L结晶紫溶液,再加入2.0 mL 1.0 mmol/L FeSO4、1.0 mL不同浓度复合保鲜剂(2、4、6、8、10 μg/mL)、2.0 mmol/L H2O2溶液,调节pH为4.0,定容至50 mL后摇匀,30 min后测580 nm处的吸光值Ai,以等量蒸馏水替代H2O2溶液和复合保鲜剂,测得吸光度值为A,以等量蒸馏水替代复合保鲜剂作对照,测得吸光值为A0,清除率公式如下所示，单独使用1、2、3、4、5 μg/mL的茶多酚、肉桂精油二者清除率相加做对照。

1.3.3 复合保鲜剂对超氧阴离子自由基清除能力测定 用邻苯三酚自氧化法[13]测定超氧阴离子自由基清除效果。每支试管中加入3 mL pH为8.2的Tris-HCl缓冲液,0.1 mL复合保鲜剂(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),在(25±0.5) ℃下水浴平衡20 min,再加入7 mmol/L的邻苯三酚溶液,反应4 min后加入1 mL 10 mol/L的HCl使反应停止,在420 nm处测吸光值，清除率公式如下所示。用茶多酚、肉桂精油二者清除率相加做对照。

式中,A0-空白组即不加样品的吸光值;AX-加入样品后的吸光值。

1.4复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌抑菌作用研究

1.4.1 菌种活化及菌悬液的制备 将低温保藏的金黄色葡萄球菌接种在TSA固体培养基上,在37 ℃下培养36 h后挑取5个单菌落接种在TSB液体培养基中,37 ℃、150 r/min摇床培养17 h,以5000 r/min离心6 min,菌体沉淀用已灭菌的TSB稀释,对照麦氏比浊管,使菌液浓度稀释至106CFU/mL作为菌悬液待用。

1.4.2 抑菌效果及最小抑菌浓度(MIC)研究 按照二倍稀释法将复合保鲜剂配成浓度为10、8、6、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。使用琼脂平板打孔法[14],对不同浓度的复合保鲜剂进行抑菌圈测定,从而确定MIC。

1.4.3 抑菌活力的测定 将复合保鲜剂分别加入到10 mL的试管中,加入菌悬液,使保鲜剂浓度为MIC与1/2 MIC,37 ℃、150 r/min摇床进行培养,用不含菌的液体培养基作为空白对照组。培养不同时间(1、2、3、4、5、6、7 h),用自动酶标仪测定620 nm处的吸光值(A),按照Haanen Haanen M[15]等的方法计算抑菌活力(U)，公式如下所示。将培养时间作为横坐标,抑菌活力作为纵坐标作出曲线,得到抑菌活性峰出现的时间和数量。

式中,A0-空白对照组吸光值;A-样品组不同处理时间吸光值。

1.4.4 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 取10 mg/mL的复合保鲜剂0.5 mL和0.25 mL分别加到9.5 mL和9.75 mL已制备菌悬液中,使保鲜剂浓度为MIC与1/2 MIC,37 ℃、150 r/min摇床培养,用不含有保鲜剂的无菌水作为对照组,每隔2 h分别取样,利用紫外分光光度计测定菌液在620 nm处的吸光值[16]。将培养时间作为横坐标,OD620作为纵坐标,绘制出金黄色葡萄球菌的生长曲线。

1.4.5 复合保鲜剂对菌体细胞壁的影响 取10 mg/mL的复合保鲜剂0.5 mL和0.25 mL分别加到9.5 mL和9.75 mL已制备菌悬液中,使保鲜剂浓度为MIC与1/2 MIC,37 ℃ 150 r/min摇床培养,用不含有保鲜剂的无菌水作为对照组,每隔2 h分别取样,3000 r/min离心10 min,取上清液,使用试剂盒分别测定不同时间培养液中碱性磷酸酶(AKP)酶含量[17]。

1.4.6 复合保鲜剂对菌体细胞膜通透性的影响 取10 mg/mL的复合保鲜剂0.5 mL和0.25 mL分别加到9.5 mL和9.75 mL已制备菌悬液中,使保鲜剂浓度为MIC与1/2 MIC,37 ℃、150 r/min摇床培养,用不含有保鲜剂的无菌水作为对照组,每隔2 h分别取样,参照Lee[18]等的方法测定不同时间培养液的电导率值。

1.5数据处理

实验重复两次,每组数据平行测三次。数据采用SPSS Statistics 20.0进行方差分析。采用Origin 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1抗氧化效果

2.1.1 复合保鲜剂对DPPH自由基清除效果 结果如图1所示,可以看出,复合保鲜剂对DPPH自由基有很好的清除作用,且清除能力大于单独使用茶多酚溶液、肉桂精油溶液二者清除率之和。当复合保鲜剂浓度为2 μg/mL时,清除率仅有17.16%,随着浓度升高到6 μg/mL,清除率迅速升高到66.23%,IC50为4.02 μg/mL,但超过6 μg/mL时,清除率升高相对缓慢,趋于平缓。李荣等[19]发现肉桂精油在2 mg/mL时对DPPH自由基清除率为31%,说明肉桂精油对DPPH自由基清楚能力较茶多酚相差很多,可见将肉桂精油与茶多酚复配清除能力较好。马君义[20]在螺旋藻中添加10%茶多酚,研究发现比单独使用时表现出较强的协同清除DPPH自由基能力。这种协同作用的机理是通过基于氧化还原电位差的偶联氧化,偶联作用[21]。复配液降低了两种物质之前的电位落差。

图1 复合保鲜剂对DPPH自由基的清除效果

2.1.2 复合保鲜剂对羟基自由基清除效果 结果如图2所示,可以看出不同浓度的复合保鲜剂对羟基自由基均有一定的清除能力,且随着浓度的增加清除率逐渐提高,保鲜剂复合能够提高清除羟基自由基的能力。当复合保鲜剂浓度为2 μg/mL时,清除率为9.12%;随着浓度升高到4 μg/mL,清除率快速增加到30.15%;当浓度达到10 μg/mL时清除率达到53.42%,IC50为9.15 μg/mL。林美容等[22]将茶多酚与竹荪提取物复配,发现对羟基自由基的清除能力高于单独使用茶多酚或竹荪时的效果。复配液表现出来的这种协同效应可能是由于单一抗氧化剂在发挥作用之后产生的游离基直接相互作用产生新的酚类物质继续发挥作用,从而增强了对羟基自由基的清除效果[23]。

图2 复合保鲜剂对羟基自由基的清除效果

2.1.3 复合保鲜剂对超氧阴离子自由基清除效果 结果如图3所示,可以看出复合保鲜剂对超氧阴离子自由基清除率随浓度增大逐渐增大。其对超氧阴离子自由基IC50为0.61 mg/mL。孙世利等[24]研究表明茶多酚复合维生素C和维生素E对超氧阴离子自由基清除率清除效果,比使用单一抗氧化剂清除率好,这与本实验的结果类似,本实验中复合保鲜剂对超氧阴离子自由基的清除效果强于单独使用茶多酚、肉桂精油,可见复合保鲜剂对超氧阴离子自由基的清除具有协同效应,但是机理尚不明确。

图3 复合保鲜剂对超氧阴离子自由基的清除效果

2.2复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.2.1 抑菌效果及最小抑菌浓度(MIC) 可以通过抑菌圈直径的大小划分相对敏感度从而判断抑菌效果,评价标准见表1[25]。复合保鲜剂的抑菌效果见表2。从表2可以看出,浓度越高抑菌效果越好,当浓度大于0.5 mg/mL时,复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌都具有较好的抑菌效果,结合表1,当抑菌圈直径为7.8～10.0 mm之间时,复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌具有低敏效果,由此可确定复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.5 mg/mL。

表1 抑菌效果评价标准

表2 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

2.2.2 抑菌活力 抑菌活力主要通过抑菌动力学方法表征复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果。实验结果如图4所示。

图4 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的抑菌活力

由图4可知,随着作用时间的延长,抑菌活性初始阶段在不断增强,MIC和1/2 MIC浓度处理组的金黄色葡萄球菌均在4 h时出现一个活性峰,随后由于金黄色葡萄球菌繁殖加速,抑菌活性开始出现不断下降趋势。MIC浓度抑菌活性始终远远大于1/2 MIC处理组,可见复合保鲜剂浓度越大抑菌作用越强。蓝蔚青等[25]研究了壳寡糖、溶菌酶与茶多酚复配对松鼠葡萄球菌的抑菌活力,本文的研究结果与其基本一致。

2.2.3 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响 细菌培养液的吸光值可用来指示细菌的生长情况,一般情况下在液体培养基中,细菌生长呈现S型曲线规律。经MIC与1/2 MIC浓度的复合保鲜剂处理后,金黄色葡萄球菌的生长曲线如图5。

图5 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响

由图5可知,实验组和对照组均呈S型生长,对照组在培养8 h后进入对数期,经MIC和1/2MIC浓度复合保鲜剂处理后,相比于对照组,处理后细菌生长明显迟滞,经MIC浓度保鲜剂处理的细菌生长最慢。复合保鲜剂处理后的金黄色葡萄球菌生长始终处于较低水平状态,可见其抑菌效果明显。此外,复合保鲜剂处理后,曲线最大斜率变小,因此细菌的最大生长速率减小,这与石超等[26]研究的结果一致,复合保鲜剂抑制金黄色葡萄球菌的生长方式是延缓其进入对数期的时间以及抑制其最大生长速率。

2.2.4 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌细胞壁的影响 碱性磷酸酶(AKP)是一种存在于细胞膜与细胞壁之间的对生物体起重要作用的酶。当细胞处于正常生理状况下时,AKP由于被细胞壁隔离而不能在细胞外检测出,但当细胞壁受到破坏以后,AKP会大量渗透到细胞外。因此,经复合保鲜剂处理金黄色葡萄球菌后通过测定细胞外AKP含量的变化情况能够间接反映保鲜剂对细胞壁的影响。复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌细胞壁的影响如图6所示。

图6 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌细胞壁的影响

由图6可知,对照组AKP含量较稳定并且始终在一个较低的水平,在细胞外的含量很低。但经过MIC和1/2 MIC浓度复合保鲜剂处理后,在初始2 h内,AKP含量迅速升高,3 h后基本趋于稳定,并且复合保鲜剂浓度越高,AKP含量越高。这表明复合保鲜剂能够在短时间内破坏金黄色葡萄球菌细胞壁的完整性,且随着浓度的升高,破坏程度增大。

2.2.5 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响 细菌的细胞膜是保护细菌的屏障,同时也具有很多独特的生理功能,当细胞膜被破坏后,其原有的功能也将丧失,导致细胞膜的流动性和通透性增大,从而失去对菌体的保护作用,细胞内的细胞液将大量外流,细胞液中包含大量的电解质离子,将导致培养液中电导率上升,因此,测定培养液电导率的变化可以间接反映细菌细胞膜通透性的变化。复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响如图7所示。

图7 复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响

由图7可知,对照组菌液电导率呈稳定缓慢上升趋势,可能是因为随着细菌不断繁殖,培养液中菌体浓度不断增大。经过MIC和1/2 MIC浓度复合保鲜剂处理后,培养液电导率值在60 min内快速上升,且电导率值明显高于对照组,并且MIC浓度处理电导率值远高于1/2 MIC浓度处理。说明复合保鲜剂能够破坏金黄色葡萄球菌细胞膜,致使菌体内电解质外渗严重,从而起到抑菌作用,且浓度越大抑菌作用越强。

3 结论

通过测定复合保鲜剂对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除率,发现复合保鲜剂抗氧化活性随浓度增大而增强,且有效活性浓度较低,具有很强的抗氧化性。复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用,抑菌效果随浓度增大不断增强,最小抑菌浓度为0.5 mg/mL,且均在4 h时发挥最大抑菌活力。MIC和1/2 MIC浓度处理能够延缓金黄色葡萄球菌生长对数期,减小最大生长速率,破坏金黄色葡萄球菌细胞壁,并且对细胞膜通透性产生影响。

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Antioxidantactivityandantimicrobialeffectofteapolyphenols-cinnamonessentialoilcompoundpreservatives

YUXiao-liang,CHENShun-sheng*,YUNSan-yue,LIUFu-kang,SONGLing-ling

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

To determine the antioxidant activity and antimicrobial effect againstStaphylococcusaureusof tea polyphenols-cinnamon essential oil compound preservatives. The antioxidant capacity of compound preservatives was determined byinvitrooxidation resistance method. The bacteriostatic effect and the minimum inhibitory concentration(MIC)were determined by the size of the inhibition zone. The effect of compound preservatives onStaphylococcusaureuswas evaluated comprehensively by antibacterial activity,bacterial growth curve,cell wall integrity and cell membrane permeability. Results showed that IC50of compound preservatives scavenged DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide anion radical were 4.02 μg/mL,9.15 μg/mL and 0.61 mg/mL respectively. Compound preservatives could effectively inhibit the growth ofStaphylococcusaureuswith the MIC of 0.5 mg/mL,and could damage the cell wall and cell membrane. In summary,compound preservatives had a strong antioxidant activity,and had a very good antibacterial effect withStaphylococcusaureus. The possible mechanism of inhibition was to destroy the cell wall and affect the permeability of the cell membrane.

tea polyphenols;cinnamon essential oil;compound preservatives;Staphylococcusaureus;antioxidant;antimicrobial

2017-04-25

余小亮(1992-),男,硕士研究生,研究方向:水产品加工与保藏,E-mail:1280218199@qq.com。

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陈舜胜(1956-),男,硕士,教授,主要从事水产品加工与贮藏方面的研究,E-mail:sschen@shou.edu.cn。

国家自然科学基金面上项目(31471685);“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD28B05);上海市2015高校内涵建设项目(A2018150009)。

TS202.3

A

1002-0306(2017)22-0226-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.044