张晓清 李小勤 陈佳楠 徐怀兵 石 泽 冷向军,

(1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2. 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;3. 上海市水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306; 4. 上海高校知识服务平台, 上海海洋大学水产动物遗传育种中心(ZF1206), 上海 201306)

无鱼粉低磷饲料中添加中性蛋白酶和植酸酶对建鲤生长及营养物质利用的影响

张晓清1李小勤1陈佳楠1徐怀兵1石 泽1冷向军1,2,3,4

(1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306; 2. 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306;3. 上海市水产养殖工程技术研究中心, 上海 201306; 4. 上海高校知识服务平台, 上海海洋大学水产动物遗传育种中心(ZF1206), 上海 201306)

在无鱼粉低磷饲料中添加中性蛋白酶、中性植酸酶, 考察对建鲤(Cyprinus carpiovar. Jian)生长、营养物质消化率和沉积率、血浆生化指标及肠道组织学的影响。配制含鱼粉5%和磷酸二氢钙1.5%的正对照饲料、无鱼粉饲料、无鱼粉低磷饲料(磷酸二氢钙1.0%)和在无鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶, 在无鱼粉低磷饲料中添加175 mg/kg蛋白酶+300 mg/kg植酸酶的5组等蛋白饲料, 饲喂初始体重为(52.5±2.0) g的建鲤10周。结果表明: 对照组具有最高增重率和最低饲料系数(P＜0.05), 无鱼粉饲料和无鱼粉低磷饲料组的增重率、蛋白质和磷沉积率、蛋白质和钙消化率均显著下降(P＜0.05); 在无鱼粉饲料中添加蛋白酶后, 提高了建鲤增重率13.1%(P＜0.05), 达到和对照组基本一致的水平; 显著提高了蛋白质、钙消化率和肠绒毛高度, 降低了饲料系数(P＜0.05); 在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶后, 显著提高了脂肪、蛋白质、磷沉积率和蛋白质、钙、磷消化率(P＜0.05), 增加了前肠绒毛长度和隐窝深度(P＜0.05), 提高了血浆磷浓度(P＜0.05)。以上结果表明, 在全植物性蛋白饲料中添加蛋白酶, 在全植物蛋白的低磷饲料中同时添加蛋白酶和植酸酶可以促进建鲤生长, 提高对营养物质的消化率和沉积率, 促进肠道生长发育。

中性蛋白酶; 中性植酸酶; 建鲤; 生长

近年来, 水产养殖业的一个重要研究领域是植物性蛋白替代鱼粉的可持续发展和蛋白替代对全球水产养殖行业的支持。然而, 植物蛋白源通常具有氨基酸组成不平衡, 蛋白质消化率低, 含植酸、非淀粉多糖(NSP)和蛋白酶抑制剂等抗营养因子[1],影响动物生长性能。添加酶制剂是提高植物蛋白源利用率的重要途径, 可破坏抗营养因子, 提高水生动物对蛋白质、脂肪、多糖和磷的利用率, 促进生长。目前, 用于水产饲料中的酶类主要有蛋白酶[2—4]、植酸酶[5,6]、非淀粉性多糖酶[7,8]等。

蛋白酶可将大分子蛋白水解成寡肽或氨基酸,提高饲料蛋白利用率[1]。蛋白酶根据其作用的最适pH, 可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶及碱性蛋白酶。目前, 蛋白酶已得到较为广泛的研究和应用,在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[9]、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)[10]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[4]等鱼类中研究表明, 在饲料中补充蛋白酶能提高消化酶活性, 促进鱼类生长。植酸酶水解植物性原料中的植酸, 释放出肌醇、磷酸及与植酸螯合的其他营养物质, 提高磷等营养物质的利用率[5],进而促进生长。根据植酸酶水解作用时适宜pH的不同, 有中性植酸酶和酸性植酸酶之分。近年来,酸性植酸酶应用在水产动物中已见于斑点叉尾鮰(Ictalurus puuctatus)[11]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[12]等; 有关中性植酸酶应用的报道已见于花鲈(Lateolabrax japonicus)[13]、黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)[14]、异育银鲫[15]。

植物蛋白原料在水产饲料中的用量不断增加,提高其利用率, 降低饲料成本, 减少N和P向水体的排放, 越来越受到广泛关注。将蛋白酶和植酸酶复合使用, 能否达到上述目的? 因此, 本试验以建鲤(Cyprinus carpiovar. Jian)为研究对象, 在无鱼粉低磷饲料中补充中性蛋白酶和中性植酸酶, 考察对建鲤生长、营养物质消化率、营养物质沉积率、肠道组织学和血液生化指标等的影响, 为蛋白酶和植酸酶在水产饲料中的合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验用酶制剂

蛋白酶商品名为AG175, 由加拿大JEFO动物营养公司提供, 为细菌发酵产生的碱性丝氨酸蛋白酶,具有较高的耐温性[4]; 耐高温中性植酸酶由广东溢多利生物科技股份有限公司提供, 适宜pH 4.5—8.0,植酸酶活性为2000 U/g。

1.2 试验设计与试验饲料

共配制5组饲料: 正对照饲料(鱼粉5%和磷酸二氢钙1.5%)、无鱼粉饲料, 无鱼粉低磷饲料(磷酸二氢钙1.0%), 在无鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶, 在无鱼粉低磷饲料中添加175 mg/kg蛋白酶和300 mg/kg植酸酶。在各配方中添加0.025% 三氧化二钇(Y2O3)作为指示剂, 用于消化率的测定。各原料粉碎过40目筛, 逐级混匀, 用单螺杆挤压机(SLP-45, 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所)制成直径2 mm的沉性颗粒饲料[制粒温度(85±5)℃],饲料于通风阴凉处晾干, 置于4℃冰箱中保存备用。饲料配方组成分和营养水平见表1。

1.3 试验用鱼及饲养管理

试验用建鲤购自山东济南建鲤育苗场。正式试验前, 用正对照饲料饲喂建鲤1周, 使其适应试验环境和试验饲料, 选225尾体格健壮、体重均匀的建鲤(52.5±2.0) g, 随机放入15口自动充气循环过滤玻璃缸, 每缸放养15尾鱼。每个试验缸大小为0.60 m×0.55 m×0.50 m (有效水体150 L)。养殖期间, 每天投喂3次(08:30、11:30和16:30), 投饲率为2.5%—3.0%, 每次投喂时间约20min, 并根据摄食情况作相应调整, 使各缸保持基本一致的投饲量并无残饵。饲养期间每日吸污, 同时更换1/10水量; 水温26.0±2.0℃, pH 6.5—7.3; 溶解氧＞4 mg/L。

1.4 测定指标和方法

生长指标和形体指标在养殖试验结束后,鱼体饥饿24h, 统计每缸鱼尾数并称重, 计算增重率(Weight gain rate,WGR)、饲料系数(Feed conversion ratio,FCR)、存活率(Survival rate,SR)。每缸取3尾鱼, 测量其体长、体重, 解剖取内脏团、肝胰脏并称重, 计算肝体比(Hepato-somatic index,HSI)、脏体比(Viscero-somatic index,VSI)、肥满度(Condition factor,CF)。

增重率(%)=100×[(鱼终重(g)–鱼初重(g))/鱼初重(g)];

饲料系数=摄食量(g)/鱼体增重(g);

肝体比(%)=100×[肝脏重(g)/鱼体重(g)];

脏体比(%)=100×[内脏重(g)/鱼体重(g)];

肥满度(%)=100×[鱼体重(g)/鱼体长(cm)3]。

饲料、全鱼组成分析在养殖试验开始前,取6尾鱼进行初始鱼的常规体成分析。在养殖试验结束后, 每缸取3尾鱼(每处理组9尾), 置于–20℃冰箱中冻存, 用于全鱼成分分析。饲料、全鱼组成和钙、磷的测定方法如下: 水分采用105℃烘干法, 粗蛋白质(N×6.25)根据凯氏测氮法测量(2300 全自动分析仪, Foss Tecator, AB, Hoganas, Sweden), 脂肪采用索氏提取法。灰分采用550℃灼烧法(马弗炉,SXL-1008, 上海精宏实验设备有限公司, 中国)。钙、磷的测定采用EDTA络合滴定法和钼黄比色法法。在上述数据基础上, 计算蛋白质沉积率(Pretention ratio,PRR)、脂肪沉积率(Lipid retention ratio,LRR)、磷沉积率(Phosphorus retention ratio,PhRR)。

蛋白质沉积率(%)=100×(Wt×Wtp–W0×W0p)/(Wf×Wfp);

脂肪沉积率(%)=100×(Wt×Wtl–W0×W0l)/(Wf×Wfl);

磷沉积率(%)=100×(Wt×Wtph–W0×W0ph)/(Wf×Wfph)。

式中:W0为初体重(g);Wt为末体重(g);Wtp为末全鱼蛋白质含量;Wtl为末全鱼脂肪含量;Wtph为末鱼磷含量;W0p为初全鱼蛋白质含量;W0l为初全鱼脂肪含量;W0ph为初全鱼磷含量;Wf为饲料投喂量;Wfp为饲料蛋白质含量;Wfl为饲料脂肪含量;Wfph为饲料磷含量。

消化率在养殖试验的后两周, 采用虹吸法收集粪便(每天于投饲后1h收集粪便, 一天2次, 取包膜完整粪便于60℃烘干, –20℃保存待测)。测定指标包括饲料、粪便中的粗蛋白质、磷、钙、钇含量, 计算蛋白质表观消化率、钙和磷表观消化率。钇元素采用等离子体发射光谱法(ICP) (Vista MPX, VARIAN, Alo Alto, California, America), 其他指标的测定方法同上。

蛋白质表观消化率(ADC, %)=100×(a×c–b×d)/(a×c);

磷表观消化率(ADC, %)=100×(a×e–b×f)/(a×e);

钙表观消化率(ADC, %)=100×(a×g–b×h)/(a×g)。

式中:a为粪便中指示剂含量,b为日粮中指示剂含量,c为日粮中蛋白质含量,d为粪便中蛋白质含量,e为日粮中磷含量,f为粪便中磷含量,g为日粮中钙含量,h为粪便中钙含量。

表1 试验饲料组成和营养水平(风干基础)Tab. 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) (%)

血浆生化指标在养殖试验结束后, 鱼体饥饿24h, 每缸取5尾鱼, 用经肝素钠试剂润洗后的注射器尾静脉采血, 离心(4℃, 3000 r/min, 10min), 取血浆于–80℃冷冻待测。各生化指标以全自动生化分析仪(BS-200, 迈瑞, 深圳, 中国)测定: 谷丙转氨酶(ALT)(International Federation of Clinical Chemistry:IFCC法)、谷草转氨酶(AST)(IFCC法)、ALP碱性磷酸酶(AMP缓冲液法)、甘油三脂(TG)(氧化酶法)、总蛋白(TP)(双缩脲法)、白蛋白(ALB)(溴甲酚绿法)、无机磷(P)(磷钼酸法)、葡萄糖(Glu)(葡萄糖氧化酶法)。

肠道组织切片在鱼体采血后, 每缸取3尾已采血鱼, 解剖, 取前肠1—1.5 cm, 用生理盐水冲洗后用Bouin液固定24h, 进行包埋, HE染色, 光学显微镜观察, 拍照测量肠绒毛长度以及隐窝深度。使用仪器: 德国型Leika RM2235切片机, 光学显微镜下, Nikon YS100显微摄影系统, 图像分析软件Image 14.0。

1.5 数据统计与分析

试验结果以平均值±标准差表示, 使用SPSS 17.0进行单因素方差分析(ANOVA), 用Duncan’s法进行多重比较, 差异显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 生长性能和形体指标

由表2可知, 无鱼粉组和无鱼粉低磷组的增重率显著低于对照组(P＜0.05), 而饲料系数显著高于对照组P＜0.05; 在无鱼粉饲料中添加蛋白酶后, 增重率提高13.1% (P＜0.05), 饲料系数降低10.5%(P＜0.10), 且与对照组无显著差异 (P＞0.05); 在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶后, 增重率提高8.8% (P＜0.10), 饲料系数降低9.1% (P＜0.10), 达到与无鱼粉饲料组基本一致水平。各处理组在脏体比、肝体比、肥满度和成活率上无显著差异(P＞0.05)。

2.2 全鱼组成和营养物质沉积率

如表3所示, 各处理组在全鱼水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分含量方面无显著差异(P＞0.05); 无鱼粉组和无鱼粉低磷组磷含量均显著低于对照组(P＜0.05); 在无鱼粉饲料中添加蛋白酶、在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶后, 全鱼磷含量与对照组相比已无显著差异(P＞0.05);

在营养物质沉积率方面, 无鱼粉组和无鱼粉低磷组的脂肪、蛋白质和磷的沉积率均显著低于对照组 (P＜0.05); 在无鱼粉饲料中添加蛋白酶, 在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶后, 均显著提高了脂肪、蛋白质和磷的沉积率(P＜0.05)。

表2 无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶、植酸酶对建鲤生长及形体指标的影响Tab. 2 Effects of supplemental protease and phytase in low phosphorus and fish meal free diet on the growth and body index of Jian carp

表3 无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶以及植酸酶对建鲤体成分、营养物质沉积率的影响Tab. 3 Effects of supplemental protease and phytase in low phosphorus and fish meal free diet on the body composition, the rate of deposition of Jian carp (%)

2.3 营养物质消化率

由表4可见, 无鱼粉低磷组的蛋白质、钙和磷的表观消化率显著低于对照组(P＜0.05), 无鱼粉组的蛋白质和钙消化率显著低于对照组(P＜0.05); 在无鱼粉饲料中添加蛋白酶显著提高了蛋白质和钙的消化率(P＜0.05), 在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶显著提高了蛋白质、钙和磷的消化率(P＜0.05)。

2.4 血浆生化指标

由表5可见, 各处理组在血浆AST、ALT、TP、ALB、TG和Glu含量上均无显著差异(P＞0.05)。与对照组相比, 无鱼粉低磷组的血浆磷显著降低, 碱性磷酸酶(ALP)活性显著升高(P＜0.05), 在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶后, 血浆磷含量显著增加, 而ALP活性显著降低(P＜0.05)。

2.5 前肠组织学指标

由表6和图1可见, 与对照组相比, 无鱼粉组的绒毛长度和隐窝深度在数值上有所降低(P＞0.05),而无鱼粉低磷组的绒毛长度显著降低(P＜0.05); 在无鱼粉饲料中添加蛋白酶后, 前肠绒毛长度和隐窝深度显著增加(P＜0.05), 且在数值上高于对照(P＞0.05); 在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶和植酸酶,显著增加了绒毛长度(P＜0.05), 隐窝深度在数值上也有提高(P＞0.05)。各组绒毛长度/隐窝深度比值无显著差异(P＞0.05)。

3 讨论

3.1 蛋白酶和植酸酶对建鲤生长和消化率的影响

在本实验中, 以豆粕、菜粕、棉粕(1∶1∶1)等蛋白替代全部鱼粉(5%)后, 建鲤的增重率、蛋白质和钙消化率均显著下降, 说明全植物蛋白源饲料中抗营养因子较多, 其消化利用率较低, 导致鱼体生长性能下降; Shi等[4]研究表明以豆粕等蛋白代替基础饲料(含鱼粉9%)中2/3的鱼粉, 导致异育银鲫对饲料干物质和粗蛋白消化率及生长性能的显著降低,类似报道也见于日本方头鱼[16](Branchiostegus japonicus)等。蛋白酶作为酶制剂, 水解植物性蛋白,可提高水解产物中易被吸收利用的氨基酸含量[17],激活内源消化酶活性[18], 从而提高植物蛋白的利用率。本实验在无鱼粉饲料(全植物蛋白饲料)中添加蛋白酶后, 建鲤的蛋白质和钙消化率显著提高, 生长性能也显著改善, 并达到与对照组基本一致水平。陈建明等[19]在青鱼(Mylopharyngodon piceus)饲料中添加1‰蛋白酶, 显著提高了青鱼生长性能; 张娟娟等[20]在低鱼粉饲料中添加175 mg/kg蛋白酶后,虹鳟增重率提高9.42%, 饲料系数降低7.80%; 在肉鸡饲料中补充蛋白酶也显著改善了生产性能[10]; 蛋白酶对生产性能的改善, 主要来自于对消化率的改善。Drew等[13]在亚麻粕豆粕基础日粮中添加蛋白酶, 显著提高了虹鳟对蛋白质、脂肪、能量和干物质的消化率; 在低鱼粉饲料中添加150—175 mg/kg蛋白酶, 显著提高了异育银鲫的干物质和粗蛋白消化率[4]; 但在Dalsgaard等[2]的研究中, 在豆粕、葵子粕、菜粕分别替代鱼粉日粮中添加蛋白酶对虹鳟的增重率和饲料系数无显著性影响, 这可能与其日粮中只存在一种植物蛋白源, 蛋白组成结构单一有关, 同时实验用鱼的种类、大小均会影响酶制剂的效果。

表4 无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶以及植酸酶对建鲤营养物质表观消化率的影响Tab. 4 Effects of supplemental protease and phytase in low phosphorus and fish meal free diet on apparent digestibility coefficients of Jian carp (%)

表5 无低鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶以及植酸酶对建鲤血浆生化指标的影响Tab. 5 Effects of supplemental protease and phytase in low phosphorus and fish meal free diet on serum biochemical indices of Jian carp

表6 无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶以及植酸酶对建鲤肠道组织学的影响Tab. 6 Effects of supplemental protease and phytase in low phosphorus and fish meal free diet on intestinal morphology of Jian carp

图1 对照组A、无鱼粉组B和无鱼粉蛋白酶组C的前肠组织切片Fig. 1 The representative Hamp;E staining imgages of foregut in control group (A), fish meal free group (B) and fish meal free+protease group (C)

植酸酶水解植酸, 可释放出无机磷及与植酸螯合的营养物质, 从而提高营养物质和磷的利用[21]。徐树德等[14]研究表明在减少磷酸二氢钙添加量60%—100%的饲料中添加1000 FTU/kg和1500 FTU/kg中性植酸酶, 可使花鲈对总磷的消化率提高5.8%—18.9%(P＜0.05); 张晓清等[22]在含0.5%、1.0%磷酸二氢钙的异育银鲫饲料中添加400 IU/kg中性植酸酶, 秦巍伦等[5]在含2.0%和1.6%磷酸二氢钙的建鲤饲料中添加2000 U/kg酸性植酸酶均显著提高了磷的表观消化率; 磷消化率的提高, 是鱼体生长性能改善的重要原因。张璐等[22]研究表明饲料中添加200 mg/kg酸性植酸酶, 可使鲈(Lateolabraxjaponicus)增重率从859.3%提高到947.2%(P＜0.05), 类似报道也见于尼罗罗非鱼[23]、虹鳟[24]等。本实验在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶+植酸酶后, 提高了蛋白质、钙和磷的消化率, 显著改善了建鲤生长性能, 这种改善应该是来自于植酸酶和蛋白酶的共同作用。

不同酶制剂的配伍, 如能发挥各自的作用, 则可起到协同效应。万振环等[25]在肉鸡日粮中添加蛋白酶和植酸酶, 显著提高了磷的表观消化率, 降低了粪便中磷、氮排放; 在日粮中添加植酸酶和木聚糖酶可改善Ca、P利用率, 但单独添加木聚糖酶对矿物质利用率无显著影响[26]; 在Olukosi等[27]的研究中, 添加蛋白酶、淀粉酶和木聚糖酶复合酶制剂未能够改善肉仔鸡生长性能, 但复合酶制剂与植酸酶的混合添加显著提高了体增重。本实验在无鱼粉低磷饲料中添加蛋白酶+植酸酶后, 显著提高了蛋白质、钙和磷的消化率。可见, 蛋白酶与植酸酶的复合使用, 具有更大的经济效应, 更有利于提高氮、磷利用率。由于本次试验没有设置单独添加植酸酶的组, 故难以分辩出两种酶各自的贡献度,这有待于今后的进一步研究。

3.2 蛋白酶和植酸酶对建鲤体成分和沉积率的影响

陈建明等[19]在青鱼饲料中添加不同浓度中性蛋白酶对全鱼的营养组成无显著性影响。张娟娟等[20]在虹鳟试验中, 高鱼粉组、低鱼粉组及低鱼粉+蛋白酶组的肌肉营养成分无显著差异。在本试验中, 各组全鱼水分、粗蛋白粗脂肪和灰分含量均无显著差异, 表明在饲养环境和营养条件相近的情况下, 鱼类的营养组成相对稳定, 但无鱼粉组和无鱼粉低磷组的全鱼磷含量均较对照组显著降低, 表明该两组饲料中的磷不能满足鱼体生长需求, 导致体内沉积下降; 前者是因为缺少鱼粉所提供的无机磷, 后者则是缺少鱼粉和磷酸二氢钙所提供的无机磷, 其磷的缺乏程度更严重; 在无鱼粉低磷饲料中补充蛋白酶+植酸酶后, 全鱼磷含量显著增加, 并达到与对照组基本一致的水平, 表明植酸酶提高了磷利用率, 促进了骨骼矿化。添加植酸酶促进骨骼矿化的报道也见于暹罗鲶(Pangasius pangasius)[28]和南亚野鲮(Labeo rohita)[29]。相应的, 生长的改善和沉积磷的增加, 使得在无鱼粉饲料中补充蛋白酶和在无鱼粉低磷饲料中补充蛋白酶和植酸酶, 提高了鱼体脂肪、蛋白质和磷的沉积率。秦巍仑等[5]在含1.6%磷酸二氢钙饲料中补充植酸酶, 也提高了建鲤幼鱼对磷的沉积率, 但在含2.0%磷酸二氢钙饲料中补充植酸酶对磷沉积率没有影响。

3.3 蛋白酶和植酸酶对建鲤血浆生化指标的影响

血浆生化指标的变化是动物健康及代谢情况的直接反映: 血浆ALT和AST主要参与机体的转氨基作用, TP和ALB含量是机体蛋白质代谢和免疫功能的反映[30], TG是脂类代谢的指标, ALP在水生动物的矿化作用和膜运输中起着非常重要作用[31], 血浆P是反应磷代谢的指标。在本实验中, 各处理组血浆ALT、AST、TP、ALB和TG均无显著性差异,但无鱼粉低磷组有着最高的ALP活性和最低的血浆P浓度, 说明当饲粮中缺乏可利用磷时, 血液磷水平较低, 此时ALP的活性增强, 以动员机体产生更多的磷用于必需的代谢; 当添加植酸酶后, 提高了植物性原料中磷的利用率, 缓解了磷的缺乏, 血液磷恢复正常水平, 骨磷周转变慢, 血浆ALP的活性降低。在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[32]试验中,添加0.2 g/kg植酸酶使碱性磷酸酶活性降低。杨维仁等[33]在肉鸡的研究也有类似结果。

3.4 蛋白酶和植酸酶对建鲤肠道组织形态的影响

建鲤是无胃鱼, 肠道是消化和吸收营养成分的主要器官, 而小肠绒毛是各种养分吸收的主要场所。肠道中的蛋白质酶解产物增加了肠壁上G细胞数量, 加强了肠道上皮对某些小肽刺激的感受能力,进而使绒毛变长, 扩大了肠上皮表面积, 有利于营养物质吸收; 绒毛短时成熟的绒毛细胞减少, 对养分的吸收能力降低; 隐窝深度则反映了细胞增殖率, 隐窝变浅表明肠上皮细胞成熟率上升[34,35]。在本实验中无鱼粉组、无鱼粉低磷组的绒毛长度和隐窝深度在数值上较对照组为低, 说明全植物蛋白饲料有损伤肠上皮的趋势, 但在本试验中尚未达到严重的程度; 在此基础上, 补充蛋白酶, 或蛋白酶+植酸酶后, 前肠绒毛长度显著增加, 隐窝深度也有不同程度的增加。张娟娟等[20]在低鱼粉的虹鳟饲料中补充蛋白酶后, 也发现虹鳟肠绒毛发达且排列整齐, 皱襞高度和面积显著增加, 说明蛋白酶能够改善肠道组织结构, 从而促进营养物质的消化利用率。由于在本次试验中没有设置单独添加植酸酶的组, 故蛋白酶+植酸酶组所带来的肠道组织学的改善是否有来自于植酸酶的作用, 即植酸酶是否具有类似作用效果, 有待于今后进一步研究。

[1]National Research Council (NRC): Nutrient Requirements of Fish and Shrimp [M]. Washington, DC, USA:National Academies Press. 2011, 1—4

[2]Dalsgaard J, Verlhac V, Hjermitslev N H,et al. Effects of exogenous enzymes on apparent nutrient digestibility in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fed diets with high inclusion of plant-based protein [J].Animal Feed Science and Technology, 2012, 171(2-4): 181—191

[3]Romero L F, Parsons C M, Utterback P L,et al. Comparative effects of dietary carbohydrases without or with protease on the ileal digestibility of energy and amino acids and AMEn in young broilers [J].Animal Feed Science amp; Technology, 2013, 181(1-4): 35—44

[4]Shi Z, Li X Q, Kabir M A,et al. Effects of a dietary protease on growth, nutrient retention and digestibility of gibel carp,Carassius auratus gibeliofed low fish meal pelleted and extruded diets compared to those fed high fish meal diets [J].Aquaculture, 2016, 460: 37—44

[5]Qin W L, Yang Y, Leng X J,et al. Effects of supplementation of phytase in diets with various monocalcium phosphate levels on growth, phosphorus utilization, body composition and digestive enzyme activity of Jian carp (Cyprinus carpiovar. Jian) [J].Journal of Shanghai Ocean University, 2015, 24(3): 383—390 [秦巍仑, 杨毅, 冷向军, 等. 不同磷酸二氢钙含量饲料中添加植酸酶对建鲤生长、磷利用、体组成和消化酶活性的影响. 上海海洋大学学报, 2015, 24(3): 383—390]

[6]Liu L W, Su J M, Zhang T,et al. Apparent digestibility of nutrients in grass carp (Ctenopharyngodon idellus) diet supplemented with graded levels of neutral phytase using pretreatment and spraying methods [J].Aquaculture Nutrition, 2013, 19(1): 91—99

[7]Nie G X, Hua X M, Wang J L,et al. The influences of xylanase added in wheat basal diet on intestinal microflora ofOreochromis niloticus[J].Journal of Fisheries ofChina, 2009, 33(5): 805—812 [聂国兴, 华雪铭, 王俊丽,等. 小麦基础饲料添加木聚糖酶对尼罗罗非鱼肠道菌群的影响. 水产学报, 2009, 33(5): 805—812]

[8]Fan C L, Han X Y, Xu Z R,et al. Effects of beta-glucanase and xylanase supplementation on gastrointestinal digestive enzyme activities of weaned piglets fed a barley-based diet [J].Journal of Animal Physiology amp; Animal Nutrition, 2009, 93(2): 271—276

[9]Drew M D, Racz V J, Gauthie R,et al. Effect of adding protease to coextruded flax: pea or canola: pea products on nutrient digestibility and growth performance of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) [J].Animal Feed Science amp; Technology, 2005, 119(1): 117—128

[10]Zhong G F, Zhou H Q. The effects of xylanase and multienzyme PS on the production performance, digestibility and the nutrient ingredients of muscles ofOreochromis niloticus[J].Journal of Zhejiang Ocean University (Natural Science), 2005, 24: 324—329

[11]Liu X B, Huang K, Fu X,et al. Study on growth performance and phosphorus equivalent of phytase in channel catfish (Ictalurus punctatus) [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(1): 57—65 [刘行彪, 黄可, 付熊, 等. 植酸酶对斑点叉尾鲴生长性能及磷当量的研究. 水生生物学报, 2012, 36(1): 57—65]

[12]Ma H J, Ye J Y, Guo J L,et al. Effect of phytase on growth, body composition and phosphorus content in tissues of juvenile grass carp (Ctenopharyngodon idellus)fed plant protein based diet [J].Journal of Shanghai Ocean University, 2011, 20(6): 845—852 [马恒甲, 叶金云, 郭建林, 等. 饲料中添加植酸酶对草鱼生长、体组成及各组织磷含量的影响. 上海海洋大学学报, 2011,20(6): 845—852]

[13]Luo L, Wu X F, Xue M,et al. Effect of replacement calcium phosphate monobasic with neutral phytase on growth and phosphorous metabolism of Japanese sea bass(Lateolabrax japonicus) [J].Chinese Journal of Animal Nutrition, 2007, 19(1): 33—39 [罗琳, 吴秀峰, 薛敏, 等.中性植酸酶在豆粕型饲料中替代磷酸二氢钙对花鲈生长及磷代谢的影响. 动物营养学报, 2007, 19(1):33—39]

[14]Xu S D, Wang S Q, You C H,et al. Effects of replacing monocalcium phosphate with phytase on growth and phosphorus utilization in black sea bream,Acanthopagrus schlegelii[J].Journal of Fishery Sciences of China,2014, 21(3): 522—530 [徐树德, 王树启, 游翠红, 等. 中性植酸酶替代磷酸二氢钙对黑鲷生长和磷利用的影响.中国水产科学, 2014, 21(3): 522—530]

[15]Zhang X Q, Xu S D, Li X Q,et al. Effects of supplementation of neutral phytase in diets with various monocalcium phosphate levels on growth, nutrients digestibility and deposition of crucian carp (Carassius auratus gibelio) [J].Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5):1598—1608 [张晓清, 徐树德, 李小勤, 等. 不同磷酸二氢钙含量饲料中添加中性植酸酶对异育银鲫生长及营养物质表观消化率、沉积率和血浆生化指标的影响.动物营养学报, 2016, 28(5): 1598—1608]

[16]Takahashi K, Kurose K, Okazaki E,et al. Effect of various protease inhibitors on heat-induced myofibrillar protein degradation and gel-forming ability of red tilefish(Branchiostegus japonicus) meat [J].LWT-Food Science and Technology, 2016, 68: 717—723

[17]Lu C. Effects of neutral protease and acid protease on growth performance, nitrogen and amino acid digestibility in weaned piglets [D]. Shenyang Agricultural University, 2010 [卢晨. 中性和酸性蛋白酶对断奶仔猪生长性能、氮及氨基酸消化率的影响. 沈阳农业大学, 2010]

[18]Leng X J, Liu D Y, Li X Q,et al. Effects of protease ag on growth and digestive protease activities of common carp (Cyprinus carpioL.) fingerling [J].Chinese Journal of Animal Nutrition, 2008, 20(3): 268—274 [冷向军, 刘鼎云, 李小勤, 等. 饲料中添加蛋白酶AG对鲤鱼鱼种生长和蛋白质消化酶活性的影响. 动物营养学报, 2008,20(3): 268—274]

[19]Chen J M, Ye J Y, Xu Y X,et al. Effect of adding neutral protease to diets on growth, performance, digestion and body composition of fingerling black carp (Mylopharyngodon piceus) [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2009,33(4): 726—731 [陈建明, 叶金云, 许尧兴, 等. 饲料中添加中性蛋白酶对青鱼生长、消化及鱼体组成的影响.水生生物学报, 2009, 33(4): 726—731]

[20]Zhang J J, Li X Q, Leng X J,et al. Effects of supplemental protease on growth and intestinal tissue structure in rainbow troutOncorhynchus mykiss[J].Journal of Dalian Ocean University, 2012, 27(6): 534—538 [张娟娟,李小勤, 冷向军, 等. 外源蛋白酶对虹鳟生长和肠道组织结构的影响. 大连海洋大学学报, 2012, 27(6):534—538]

[21]Cheng Z J, Hardy R W. Effect of microbial phytase on apparent nutrient digestibility of barley, canola meal,wheat and wheat middlings, measured in vivo, using rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) [J].Aquaculture Nutrition, 2003, 8(4): 271—277

[22]Zhang L, Ai Q H, Mai K S,et al. Effect of phytase and non-starch polysaccharide enzymes supplementation in diets on growth and digestive enzymes activity for Japanese Sea Bass (Lateolabrax japonicus) [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2009, 33(1): 82—88 [张璐, 艾庆辉, 麦康森, 等. 植酸酶和非淀粉多糖酶对鲈鱼生长和消化酶活性的影响. 水生生物学报, 2009, 33(1): 82—88]

[23]Hassaan M S, Soltan M A, Agouz H M,et al. Influences of calcium/phosphorus ratio on supplemental microbial phytase efficiency for Nile tilapia (Oreochromis niloticus)[J].Egyptian Journal of Aquatic Research, 2013, 39(3):205—213

[24]Vielma J, Mäkinen T, Ekholm P,et al. Influence of dietary soy and phytase levels on performance and body composition of large rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and algal availability of phosphorus load [J].Aquaculture, 2000, 183(3-4): 349—362

[25]Wang Z H, Yuan J M, Guo Y M,et al. Research in decreasing nitrogen and phosphorus excretion by using phytase in combination with protease and compound enzyme in broiler diet [J].Journal of China Agricultural University, 2009, 14(5): 80—85 [万振环, 袁建敏, 呙于明, 等. 蛋白酶和植酸酶联合添加降低肉仔鸡氮磷排放的研究. 中国农业大学学报, 2009, 14(5): 80—85]

[26]Woyengoa T A, Guentera W, Sandsb J S,et al. Nutrient utilisation and performance responses of broilers fed a wheat-based diet supplemented with phytase and xylanase alone or in combination [J].Animal Feed Science amp;Technology, 2008, 146(1): 113—123

[27]Olukosi O A, Cowieson A J, Adeola O. Age-related influence of a cocktail of xylanase, amylase, and protease or phytase individually or in combination in broilers [J].Poultry Science, 2007, 86(1): 77—86

[28]Debnath D, Sahu N P, Pal A K,et al. Mineral status ofPangasius pangasius(Hamilton) fingerlings in relation to supplemental phytase: absorption, whole-body and bone mineral content [J].Aquaculture Research, 2005b, 36(4):326—335

[29]Kartik B, Sahu N P, Pal A K,et al. Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude protein level on mineral utilization by rohu, (Labeo rohita), (Hamilton),juveniles [J].Journal of the World Aquaculture Society,2007, 38(2): 238—249

[30]Kumar V, Makkar H P S, Devappa R K,et al. Isolation of phytate from Jatropha curcas, kernel meal and effects of isolated phytate on growth, digestive physiology and metabolic changes in Nile tilapia (Oreochromis niloticus,L.) [J].Food amp; Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association, 2011, 49(9): 2144—56

[31]Bernet D, Schmidt H, Wahli T,et al. Effluent from a sewage treatment works causes changes in serum chemistry of brown trout (Salmo trutta, L.) [J].Ecotoxicology amp;Environmental Safety, 2001, 48(2): 140—147

[32]Zhu Y, Qiu X, Ding Q,et al. Combined effects of dietary phytase and organic acid on growth and phosphorus utilization of juvenile yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) [J].Aquaculture, 2014, 430(2): 1—8

[33]Yang W R, Wang Q Y, Yang Z B,et al. Effects of phytase supplementation on growth and serum minerals in broiler chicks fed diets with different levels of inorganic phosphorus [J].Journal of China Agricultural University,2008, 13(4): 87—92 [杨维仁, 王庆云, 杨在宾, 等. 不同无机磷水平日粮添加植酸酶对肉鸡生长性能和血清矿物质的影响. 中国农业大学学报, 2008, 13(4): 87—92]

[34]Li Q. The study on intestinal histology and developing regulation of nutrients of allogynogenetic crucian [D].Nanjing Agricultural University. 2007 [李茜. 异育银鲫肠道组织形态学分析及肠道发育的营养调控. 南京农业大学. 2007]

[35]Gracia M I, Lázaro R, Latorre M A,et al. Influence of enzyme supplementation of diets and cooking-flaking of maize on digestive traits and growth performance of broilers from 1 to 21 days of age [J].Animal Feed Science amp; Technology, 2009, 150(3): 303—315

EFFECTS OF SUPPLEMENTATION OF NEUTRAL PROTEASE AND NEUTRAL PHYTASE IN FISH MEAL FREE DIET WITH LOW PHOSPHORUS LEVEL ON GROWTH, NUTRIENTS DIGESTIBILITY AND DEPOSITION OF JIAN CARP(CYPRINUS CARPIO VAR. JIAN)

ZHANG Xiao-Qing1, LI Xiao-Qin1, CHEN Jia-Nan1, XU Huai-Bing1, SHI Ze1and LENG Xiang-Jun1,2,3,4
(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Fishery Cermplasm Resources, Ministry of Aquaculture, Shanghai 201306, China; 3. Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306, China; 4. Shanghai University Knowledge Service Platform Aquatic Animal Breeding Center(ZF1206), Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To evaluate the effects of the supplementation of neutral protease and neutral phytase in fish meal free diet with low phosphorus level on the growth, nutrients digestibility, nutrients deposition, serum biochemical index, and intestinal morphology of Jian carp (Cyprinus carpiovar. Jian), five diets were prepared as the positive control diet [5%fish meal, 1.5% Ca(H2PO4)2], fish meal free diet (FMF) supplemented without or with 175 mg/kg protease, low phosphorus and fish meal free diet [1.0% Ca(H2PO4)2, LP-FMF] supplemented without or with 175 mg/kg protease+300 mg/kg phytase (LP-FMF+Pr+Ph), respectively, for a 10-weeks trial. The results indicated that the control group had the highest weight gain rate (WGR) and the lowest feed conversion ratio (FCR) among all groups (P＜0.05). TheWGR, the retention ratios of protein and P, the digestibilities of protein and calcium of FMF group and LP-FMF group were significantly lower than those of control group (P＜0.05). The supplementation of protease (FMF+protease) improved theWGRby 13.1% (P＜0.05), and promoted the digestibilities of protein and calcium, and improved the foregut villus length, and decreased theFCR(P＜0.05) compared with FMF group. The LP-FMF+Pr+Ph group showed the higher retention ratios of lipid, protein and phosphorus (P＜0.05), the higher digestibilities of protein, phosphorus and calcium(P＜0.05), the longer villus length and crypt depth, and the higher serum phosphorus level (P＜0.05) than the LP-FMF group. These results indicated that the supplementation of protease in fish meal free diet and the supplementation of protease and phytase in low phosphorus and fish meal free diet could improve the growth performance, the digestibility and retention ratios of nutrients, and promote the intestinal development of Jian carp.

Neutral protease; Neutral phytase; Jian carp; Growth

S963.73

A

1000-3207(2017)06-1291-10

2016-08-04;

2016-11-15

上海市自然科学基金(13ZR1419600)资助 [Supported by the Natural Science Foundation of Shanghai (13ZR1419600)]

张晓清(1990—), 女, 浙江嘉兴人; 硕士研究生; 研究方向为动物营养与饲料。E-mail: 1214385506@qq.com

冷向军, 男, 教授, 博士生导师；E-mail: xjleng@shou.edu.cn

10.7541/2017.160

doi: 10.7541/2017.161