罗成江，包爱情，陆春波，陈晓林，王 彬，林仙军

(浙江省兽药饲料监察所，杭州 311101)

氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的检测方法研究

罗成江，包爱情，陆春波，陈晓林，王 彬，林仙军

(浙江省兽药饲料监察所，杭州 311101)

建立氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的检测方法。对1批氟苯尼考注射液照《中国兽药典》2010版HPLC法进行含量测定时，发现未知物质峰。采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UHPLC-Q/TOF MS)对该批检品进行筛查，发现该添加物疑似二氧丙嗪，并采用高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)对二氧丙嗪进行定性和定量检测。结果显示，高效液相色谱法二氧丙嗪在1～100 μg/mL浓度范围内的线性良好(r=1.0000)，平均回收率为99.5%，RSD为0.3%。本方法专属性强，灵敏度高，重现性好，适用于氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的检测。

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱；高效液相色谱法；氟苯尼考注射液；二氧丙嗪

氟苯尼考收载于《中华人民共和国兽药典》2010年版一部，是动物专用的氯霉素类新型广谱抗生素，主要用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。该药以甲砜基取代氯霉素分子结构中的硝基，消除了不可逆性致再生障碍性贫血的毒副作用；以氟基取代甲砜霉素分子结构中α-甲基位上的羟基，不仅抗菌活性增强，而且对大部分耐氯霉素和甲砜霉素的菌株仍有活性[1-3]。二氧丙嗪为抗组胺药，是异丙嗪的衍生物，又名双氧丙嗪、双氧异丙嗪、克咳敏，属人用药品，具有镇咳、平喘、祛痰、抗炎和局部麻醉作用。临床用于镇咳、祛痰，用于急慢性气管炎和各种疾病引起的咳嗽。二氧丙嗪治疗量与中毒量接近，不得超过极量，高空作业及驾驶车辆、操纵机器者禁用；癫痫、肝功能不全者应慎用[4-5]。

目前，为了有力打击非法添加药物的情况，我国农业部发布了第2448号等公告[6]，制订了氟苯尼考制剂中非法添加磺胺类、氟喹诺酮类等化学药物检查方法。但由于二氧丙嗪属人用药品，已发布的农业部公告中尚不涉及二氧丙嗪的检查，因此在参考了相关文献[7]的基础上，本文对氟苯尼考注射液中非法添加二氧丙嗪的检查方法进行了研究。

1 材 料

1.2 药品与试剂

1.2.1 对照品 盐酸二氧丙嗪对照品来自中国食品药品检定研究院，含量99.9%，批号100299-201202。

1.2.2 试剂 乙酸铵，分析纯，西陇化工股份有限公司；冰醋酸，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；三乙胺，分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；乙腈，色谱纯，Merck KGaA公司；甲醇，色谱纯，Merck KGaA 公司；水，超纯水。

1.2.3 供试品

1.2.3.1 阴性氟苯尼考注射液 氟苯尼考注射液，批号79SF-2，生产企业为西班牙海博莱生物大药厂。

1.2.3.2 阳性氟苯尼考注射液 氟苯尼考注射液，批号20160615，生产企业为四川省某公司。

1.2.3.3 阳性添加氟苯尼考注射液 在阴性氟苯尼考注射液中添加盐酸二氧丙嗪对照品，混匀，根据二氧丙嗪药物添加达到一定药效和市场临床使用剂量，共添加3个浓度，分别为1mL∶1mg、1 mL∶2mg和1mL∶5mg。

对于寡这个词，我们岭北周村的人是有一番见解的。用在特定的女人身上，那是真正的寡，守寡的寡。但用在寡这个寡那个的时候，就代表坑蒙拐骗了。所以，我们岭北周村人管坑蒙拐骗的人也叫寡子。周老相公讲的就是寡子，现在这个寡子是女的，她叫常爱兰。

2 方法与结果

2.1 UHPLC-Q/TOF MS法

2.1.1 供试品溶液的制备 精密量取1 mL氟苯尼考注射液，置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.2 液相及质谱条件 采用十八烷基键合硅胶色谱柱(Waters Atlantis, 150 mm×3.0 mm, 3 μm)，流动相A为5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液，流动相B为5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脱程序：0～1 min，5% B；1～4 min，5% B～60% B；4～14 min，60% B～100% B；14～18 min，100% B，后运行3 min，5% B；流速0.5 mL/min；柱温25 ℃；进样量2 μL。质谱采用Dual AJS ESI源，扫描方式为正离子全扫描(ESI+)，毛细管电压4.0 KV，干燥气流速为15 L/min，温度为350 ℃；鞘气流速为12 L/min，温度为350 ℃；碰撞电压(Fragmentor)为350 V。一级质谱数据采集为单级质谱全扫描模式，扫描范围：m/z100～1000 Da；采集速率为1.5 spectra/s。采集数据时连续导入参比溶液，对仪器质量轴进行实时校正，参比离子为m/z121.0509和m/z922.0098。

2.1.3 筛查结果 使用UHPLC-Q/TOF MS对1.2.3.2项下供试品进行一级质谱数据采集，总离子流图(TIC)如图1所示，TIC图中在5.901 min有明显的峰，对该峰进行质谱提取，得到m/z317.1312处响应明显大于其他离子的离子(图2)。在已经建立的一级数据库中进行匹配，发现二氧丙嗪的[M+H]+与m/z317.1312匹配且保留时间一致，匹配分数为92.25，怀疑该未知物为二氧丙嗪。

图1 总离子流图Fig 1 The chart of total lon chromatograms

图2 质谱提取图Fig 2 The chart of mass spectrometry extraction

2.2 液相色谱法

2.2.1 溶液的制备

2.2.1.1 对照品溶液的制备 取盐酸二氧丙嗪对照品约200 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀制成20 mg/mL的对照品储备液。精密量取上述对照品储备液适量，加甲醇定量稀释成20 μg/mL的二氧丙嗪对照品溶液，即得。

2.2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取1 mL氟苯尼考注射液，置100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.2.2 高效液相色谱条件 色谱柱为Agilent XDB-C18 (4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；以醋酸盐缓冲液(取0.05 mol/L的醋酸铵溶液1000 mL，加三乙胺1 mL，用冰醋酸调节pH值至6.5 )-乙睛(70∶30)；采用二极管阵列检测器，采集波长范围为200～400 nm，分辨率为1.2 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL；记录光谱图和226 nm波长处的色谱图。色谱图见图3，光谱图见图4。

2.3 峰纯度及光谱匹配检查 对供试品溶液及对照品溶液色谱图中二氧丙嗪色谱峰进行峰纯度检查，结果见图5。结果表明，供试品溶液及对照品溶液色谱图中二氧丙嗪峰的纯度因子均大于阈值，均为单一物质峰。对供试品溶液及对照品溶液色谱图中二氧丙嗪色谱峰光谱图进行匹配，匹配因子为999.771，可认为是同一物质。

图3 二氧丙嗪对照品(A)、阴性样品(B)、阳性添加(C)、空白溶剂(D)色谱图Fig 3 The chromatogram of (A)dioxopromethazine reference substance;

图4 对照品(A)和阳性添加供试品(B)紫外吸收光谱图Fig 4 Ultra-violet absorption spectra of (A) reference substance and (B) the spiked sample

A 供试品溶液峰纯度检查：纯度因子999.048，阈值999.002; B 对照品溶液峰纯度检查：纯度因子999.737，阈值999.201A: The peak purity test of sample; The purity factor is 999.048, the threshold value is 999.002.B: The peak purity test of the reference substance; The purity factor is 999.737, the threshold value is 999.201.图5 峰纯度检查图Fig 5 The chart of peak purity test

2.4 线性关系考察 分别精密量取2.2.1.1项下的盐酸二氧丙嗪对照品储备液，用甲醇稀释成1、2、4、10、20、100 μg/mL的系列混合对照品溶液，从低浓度到高浓度依次进样，按上述色谱条件分析，以峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，进行线性回归分析，回归方程为Y=48.85X-4.541(r=1.0000)，结果表明二氧丙嗪进样浓度在1～100 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 添加回收试验 按1.2.3.3项下方法制备阳性添加样品，每个添加含量做5份平行样，按2.1.1.2项下方法制备供试品溶液。按照外标法定量，回收率结果见表1。从回收率结果可以看出本实验平均回收率为99.5%，RSD为0.3%。

表1 二氧丙嗪回收率结果(n=5)Tab 1 The result of the recovery rate of dioxopromethazine

2.6 检测限 按上述色谱条件，将对照品溶液逐步稀释，同时记录色谱图及光谱图(图6)，以光谱图失真的最大浓度为检出限，该色谱条件下二氧丙嗪在氟苯尼考注射液样品中的检出限为0.2 mg/mL。

图6 二氧丙嗪检出限(浓度2 μg/mL)色谱图(A)和光谱图(B)Fig 6 (A)The chromatogram and (B)spectrogram of detection limit of dioxopromethazine (The concentration was 2 μg/mL)

2.7 耐用性 从柱温、流动相pH值、色谱柱三个方面考察方法的耐用性。分别改变柱温为25 ℃、30 ℃、35 ℃，流动相的pH值6.3、6.5、6.7，色谱峰出峰顺序无变化，保留时间稍有变化；使用不同品牌、不同型号的色谱柱，如Agilent XDB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；Agilent Plus C18 (4.6 mm×250 mm, 5μm)；Waters Symmetry C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)等，结果表明，氟苯尼考与二氧丙嗪能很好地分离且保留时间合理。本方法的耐用性较好。

2.8 稳定性试验 供试品溶液分别于配制0、1、2、4、8、12、24 h后，进样10 μL测定，RSD为1.0%。结果表明溶液自制备后24 h内基本稳定。

2.9 样品测定 取氟苯尼考注射液(批号为20160615)1.0 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。分别精密量取供试品溶液和二氧丙嗪对照品溶液(20 μg/mL)10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图和光谱图，平行测定3次，计算平均含量。结果表明供试品溶液二氧丙嗪色谱峰与二氧丙嗪对照品溶液色谱峰保留时间一致，光谱相似；此批氟苯尼考注射液二氧丙嗪平均含量为0.96 mg/mL，RSD为0.2%。

3 讨论与小结

3.1 未知物的发现和分析 本文从发现该批样品的非法添加物到建立UHPLC-Q/TOF MS筛查确证和HPLC-DAD双重确证及含量测定，最后总结出一种较好的模式化筛查流程，为未来兽药处方外非法添加提供了一定的思路，对打击兽药处方外添加有较好的实际应用价值。随着农业部对兽药非法添加的检查力度加大，兽药的非法添加也越来越隐蔽，二氧丙嗪为人用药物，此次二氧丙嗪的检出，是否意味兽药的非法添加不仅仅局限于兽用药，希望由此引起有关部门的重视。

3.2 色谱条件、提取溶剂和提取波长的选择 本试验的色谱条件参考二氧丙嗪含量检测的相关文献，二氧丙嗪在226nm有最大吸收，故选择检测波长为226nm。对二氧丙嗪在甲醇中的溶解性进行考察，发现在本方法浓度范围内，二氧丙嗪在甲醇中的溶解性良好。考虑到在非法添加高通量筛查中以甲醇作为溶剂具有普适性，选取甲醇作为提取溶剂。

3.3 检测限与定量限的确立 本方法采用二极管阵列检测器进行定性定量测定，由于需要对被测试药物优先进行定性判断，故本研究检出限以光谱图失真为依据，与传统含量测定以信噪比 1∶3作为检出限有所不同，在光谱图失真时信噪比仍大于1∶10，故未对定量限再作规定。

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[6] 中华人民共和国农业部. 公告第2448号.

Ministry of Agriculture of the People 's Republic of China .Bulletin No. 2448.

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Song Y J.Content determination of dioxyprainethazine hydrochloride tablets by HPLC [J]. China Medicine And Pharmacy, 2012, 2(20): 91-92.

(编辑：陈希)

DeterminationofDioxopromethazineIllegallyAdulteredintoFlorfenicolInjection

To establish a method for determination of dioxopromethazine illegally added in florfenicol injection. In the course of content determination of 1 batch florfenicol injection with the method of HPLC according to the Chinese Veterinary Pharmacopoeia 2010, a suspicious compound peak was found. The suspicious compound was found by quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry (UHPLC-Q/TOF MS)，then confirmation and content determination were completed by high performance liquid chromatography-diode array detector (HPLC-DAD) . The suspicious compound in this sample was identified as dioxopromethethazine. The results showed that there was a good linear correlation between the peak areas and the concentrations of dioxopromethazine at the range of 1～100 μg/mL(r=1.0000). The average recovery was 99.5% withRSDof 0.3% by HPLC. The method is convenient, reliable and accurate. It was suitable for detection of dioxopromethazine illegally adulterated in florfenicol injection.

UHPLC-Q/TOF MS；HPLC； florfenicol injection；dioxopromethazine

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.07

2017-02-03

A

1002-1280 (2017) 11-0044-07

S859.79

公益性行业(农业)科研专项(201203023-4)；浙江省“三农六方”科技协作专项(中兽药注射剂中非法添加物控制技术研究与风险监测)

罗成江，兽医师，从事兽药、畜产品安全检测技术研究。 E-mail: luocj2001@163.com

LUO Cheng-jiang, BAO Ai-qing, LU Chun-bo, CHEN Xiao-lin,WANG Bin, LIN Xian-jun

(ZhejiangProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff，Hangzhou311101,China)