黄小洁，杨承槐，刘 丹，侯力丹，李慧姣，李俊平，陈晓春

(中国兽医药品监察所，北京100081)

运用实时荧光定量PCR法检测感染鸡种蛋中的REV

黄小洁，杨承槐，刘 丹，侯力丹，李慧姣，李俊平*，陈晓春*

(中国兽医药品监察所，北京100081)

为研究通过种蛋检测的方法监测SPF鸡群REV感染情况，运用已建立的荧光定量PCR方法检测攻毒母鸡种蛋中REV，并与血清REV水平进行比较。人工感染12月龄母鸡，从种蛋中提取蛋清，接种正常鸡胚成纤维细胞后传代一次，之后石蜡密封孵化至9日龄制成鸡胚成纤维细胞(CEF)，运用荧光定量PCR方法检测蛋清，并和血清的检测结果进行比较，结果显示：83份蛋清，3份阳性样品分别收集自攻毒后的第8、11、14天；46份CEF，2份阳性样品分别收集自攻毒后的第11天和第14天，阳性的蛋清和CEF呈对应关系，说明两种方法的检测结果一致。攻毒后的6～15 d是病毒血症持续期，阳性鸡蛋均采集自这段时间，表明通过种蛋REV检测能反映SPF鸡的急性感染状态。本研究为通过种蛋抗原检测从而监测SPF鸡REV感染奠定基础。

网状内皮组织增生症病毒；荧光定量PCR；血清；蛋清；鸡胚成纤维细胞

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis，RE)是指由反转录病毒科网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)引起的禽类以急性网状细胞肿瘤、生长抑制综合症、淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤形成为特征的一群病理综合症。REV与禽白血病病毒(Avian leukemia virus, ALV)、马立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV)并称为鸡群的三大肿瘤性病毒，严重危害我国的家禽养殖业。

REV属正反转录病毒科，γ反转录病毒属，为单股、正链、线性RNA。REVS基因组RNA是由两个30～40s的RNA亚单位的60～70复合体组成[1]，分离株存在3个明显的亚型，网状内皮组织增殖病病毒T株(SNV)鸭传染性贫血病毒(DIAV)、鸡合胞体病毒(CSV)[2]，不同毒株具有相同的抗原性。REV的传统检测方法包括免疫荧光、病毒分离培养、血清学等方法。然而，这些方法在敏感性、特异性、时效性等方面存在各自的不足。国标中，检测SPF鸡REV感染的方法主要是采用血清学的方法，然而血清的采集不仅费时费力，疫苗企业要获得可靠的血清作为检测样品也很困难。因此，亟待建立一种更为快速、方便、可靠的检测方法来准确诊断SPF鸡的REV感染情况。

近年来，实时荧光定量PCR(Fluo rescent quantitative PCR)技术以其快速、灵敏、特异性强等优点在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用[3-5]。本研究运用已建立的REV实时荧光定量PCR方法[2]，对人工感染REV母鸡的血清及种蛋进行检测，探讨种蛋检测方法的可行性，为通过种蛋抗原检测从而监测SPF鸡REV感染奠定基础。

1 材 料

1.1 病毒 REV MD-2株，病毒含量为104.34TCID50，由中国兽医药品监察所分离保存。

1.2 SPF种鸡和种蛋 5只12月龄的成年SPF母鸡，2只SPF公鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；100枚SPF种蛋，购自5家SPF鸡胚生产企业；30枚普通鸡蛋购自北京某鸡场。

1.3 主要试剂 OMEGA总RNA提取试剂盒购自OMEGA公司；SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒、PrimeScript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自大连宝生物(Takara)工程有限公司；蛋白酶K溶液购自天根生化科技有限公司；无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇购自国药集团。

2 方 法

2.1 样品采集

2.1.1 动物试验 实验组：4只母鸡和1只公鸡放于一个隔离器内饲养，每只母鸡肌肉注射105TCID50的REV MD-2株强毒，分别标记为1-4号鸡；对照组：1只公鸡和1只母鸡放于另一隔离器，注射与实验组相同剂量的生理盐水，标记为5号鸡。两组鸡同饲养两个月，每天收集种蛋，三天采一次全血分离血清，做好标记，保存于-20 ℃冰箱。

2.1.2 制作鸡胚成纤维细胞(CEF) 按照《中国兽药典》(二O一O版三部)[6]方法制作。

2.2 样品采集及处理

2.2.1 感染种蛋蛋清的提取及CEF的制作 用1 mL注射器吸取0.5 mL蛋清，随后立即用石蜡密封，将种蛋放入孵化箱孵化；受精蛋孵化至9日龄按1.2.2的方法制成鸡胚成纤维细胞(CEF)；蛋清样品用PBS进行10倍稀释，取1 mL接种CEF，放于5% CO2、37 ℃培养箱培养1 h，弃去蛋清，用PBS洗涤2～3次，补充细胞维持液，放入培养箱培养5 d后传代一次冷藏备用。

2.2.2 血清中病毒DNA提取 按OMEGA总RNA提取试剂盒说明从血清中提取病毒RNA；按照PrimeScript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明将RNA反转录成cDNA，保存于-80 ℃冰箱。

2.2.3 蛋清细胞培养物、CEF细胞DNA提取 取437.5 μL病毒液于1.5 mL Eppdendorf管中，分别加入12.5 μL proteinase K(20 mg/mL)， 50 μL 10% SDS充分混匀后56 ℃水浴60 min；加入500 μL酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 r/min离心15 min，取上层水相；加入900 mL冰冷的无水乙醇和45 mL 3 mol/L NaAC(pH5.2)，-20 ℃沉淀过夜；加入450 μL氯仿-异戊醇(24∶1)，上下颠倒混匀，室温放置5 min，4 ℃，12000 r/min离心10 min，取上层水相；4 ℃，12000 r/min离心20 min沉淀核酸；弃上清，加入450 μL 70%乙醇，混匀后4 ℃，12000 r/min离心20 min，弃上清；将Eppdendorf管倒扣于吸水纸上，室温下使乙醇自然挥发；加入30 μL的双蒸水溶解核酸，-20 ℃保存备用。

2.3 样品DNA(cDNA)的荧光定量PCR检测 按照已建立的荧光定量PCR方法[1]，对提取的样品DNA(cDNA)样品进行荧光定量检测，25 μL反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL；PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL；DNA Template 2 μL；ddH2O 9.5 μL。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，40个循环。

2.4 数据分析 每个样品重复测定3次，每次取样品DNA(cDNA)模板2 μL，通过标准曲线换算出病毒基因组拷贝数平均对数值(log10 copies/μL)，再换算成1 μL样品中所含的DNA(cDNA)拷贝数平均对数值(log10 copies/μL)，3次测定结果的平均值为最终测定结果。以Ct值小于35作为阳性样品判定标准。

2.5 临床样品检测 对100枚SPF种蛋和50枚普通鸡蛋进行REV检测。

3 结 果

3.1 REV在母鸡血清中的动态分布 采集母鸡全血分离血清，攻毒后的3 d、6 d、9 d、12 d、15 d从 4只攻毒母鸡血清中均检测到病毒cDNA，将4只母鸡的检测结果取平均值，3 d时平均拷贝数约为102拷贝，6 d时约为104拷贝，9 d拷贝数达到峰值为105拷贝，12 d时降至104拷贝，15 d为102拷贝。 18 d以后检测不到病毒(图1)。对照母鸡在各个阶段血清中REV的检测结果均为阴性。

图1 REV在感染鸡体内的增殖规律Fig 1 The proliferation of REV in infected chickens

3.2 蛋清细胞培养物、CEF检测结果 两个月时间共收集感染种蛋样品83份，提取蛋清83份，接种CEF并传代一次，有3份检测结果为REV阳性，分别为感染后的第8、11、14天收集(表1)。83份鸡蛋样品中，有46份受精，孵化制成CEF样品46份，有2个样品检测结果为阳性，分别为感染后第11天和第14天收集。同一份种蛋的阳性CEF和阳性蛋清一一对应，均在感染后的11和14天收集。对照组的蛋清、CEF均为阴性。

表1 蛋清细胞培养物、CEF检测结果Tab 1 The detection result of the eggWhite cell culture and the CEF

3.3 临床样品检测结果 100枚SPF种蛋的蛋清细胞培养物100份，制成CEF细胞82份，经荧光定量PCR检测均为REV阴性；30枚普通鸡蛋的蛋清培养物有30份，均为非受精蛋，蛋清的细胞培养物经检测有11份为REV阳性(图2)，阳性率为36.7%。

1-11 阳性鸡蛋；12-30 阴性鸡蛋1-11 positive eggs；12-30 negative eggs图2 普通鸡蛋蛋清细胞培养物荧光定量PCR检测结果Fig 2 Detection result of fluorescent quantitative PCR for egg white cell culture

4 讨 论

本实验人工感染12月龄SPF母鸡，攻毒后第3天即可从血清中检测出病毒，这个结果比起雏鸡感染后出现病毒血症[7-8]的时间要早约10 d，这可能与接种的病毒毒株、接种方式不同，以及鸡的日龄大免疫机能完善等因素有关。第9天血清REV达到峰值，之后缓慢下降，第18天左右病毒血症消失，攻毒后3～18 d是病毒血症的持续时间。在蛋清的细胞培养物和CEF细胞中，检测出了REV，阳性鸡蛋的蛋清和CEF呈一一对应关系，说明这两种方法的检测结果一致，运用这两种方法检测种蛋均可行。并且检测出的阳性样品的采集时间同血清病毒血症持续的时间相一致，表明了耐受性感染的母鸡确实能把病毒垂直传播给后代。但是鸡蛋中REV检出率比较低，可能是垂直传播的几率低导致[9-11]，也可能是病毒从母鸡传播到鸡蛋后，病毒含量非常低，方法的敏感性不够而导致检测不到病毒。

SPF鸡感染REV后血清抗体持续时间很长[1]，通过抗体检测只能反映鸡群的感染历史，不能判断鸡群是否处于急性感染期，判断感染期最可靠的方法还是进行病毒检测。本实验运用建立的荧光定量PCR方法对攻毒母鸡的血清、蛋清、CEF细胞进行检测，结果表明三者出现的时间基本一致，通过对SPF种蛋进行病毒检测能如实反映鸡群的急性感染状态。但由于垂直传播率较低，实验步骤也比较繁琐，本方法是否适合大规模推广还有待进一步验证。对SPF鸡蛋和普通鸡蛋进行REV抗原检测，SPF鸡蛋REV检出率为0，普通鸡蛋的检出率36.7%，检出率较高，说明我国商品鸡群存在较高的REV感染率。

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(编辑：李文平)

DetectionofREVinSerumandEggsofInfectedChickensbyReal-timeFluorescentQuantitativePCR

HUANG Xiao-jie, YANG Cheng-huai, LIU Dan, HOU Li-dan, LI Hui-jiao, LI Jun-ping*, CHEN Xiao-chun*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

LIJun-ping,E-mail:lijunping@ivdc.org.cn;CHENXiao-chun,E-mail:chenxiaochun@ivdc.org.cn

The aim of this study was to study the egg detection indicating the REV infection status in SPF chickens. The REV of eggs in infected hens was detected by real-time PCR method already established, and compared with the serum. 12 month-old hens inoculated with REV.The egg white was extracted from the eggs and was inoculated into chicken embryo fibroblast(CEF) and passaged once, then these eggs were sealed with paraffin wax and hached, CEF was made from 9 days embryos. These egg white and CEF were detected by the real-time PCR then compared with the serum. The result showed that REV in three egg white samples could be detected from 83 samples, which collecting from the eighth and the eleventh and the fourteenth day after infection. Two CEF samples could be detected from 46 samples, which collecting from the eleventh and the fourteenth day after infection. The positive egg white and CEF was correspondence. The result indicated the two methods were consistent. The viremia continued from 6 to 18 days after attack and the positive eggs were collected from this time. The result indicated that the egg detection could be used to monitor the acute infection status in SPF chicken. The research provided a foundation for monitoring REV infection in SPF chickens by egg antigen test.

REV; real-time PCR; serum; egg white; CEF

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.03

2017-04-26

A

1002-1280 (2017) 11-0015-05

S852.65

国家重点研发计划项目“禽病检测标准物质与计量技术方法研究”课题(2016YFD0500809)

黄小洁，兽医硕士，从事禽病毒类生物制品的检验和研究工作。

李俊平，E-mail: lijunping@ivdc.org.cn；陈晓春，E-mail: chenxiaochun@ivdc.org.cn