吴剑平，张 婧，李丹妮，严 凤，潘 娟

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

液相色谱串联质谱法正负模式切换同时检测饲料中10种硝基呋喃类化合物

吴剑平，张 婧，李丹妮*，严 凤，潘 娟

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

建立了超高效液相色谱-串联四级杆质谱法检测饲料中的10种硝基呋喃类化合物的方法。饲料样品经0.1 mol/mL HCl∶乙腈=1∶1提取，高速离心后稀释，经酸性氧化铝粉末净化后进样分析。采用Thermo Hypersil Gold C18色谱柱(150 mm×2.1 mm， 1.9 μm)作为固定相，0.1%甲酸和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。质谱采用正负离子切换同时扫描，SRM模式进行分析。10种硝基呋喃类化合物在最优化条件下分离良好，在定量范围内均线性良好(线性相关系数r≥0.99)，回收率也可达到63.2% ～ 89.7% ，相对标准偏差(RSD)小于9.3%。本方法具有简便、快速、灵敏、准确等特点，适用于饲料中违法添加硝基呋喃类化合物的检测。

10种硝基呋喃药物；正负模式切换;串联质谱法

硝基呋喃类药物是一类人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，一度被广泛应用于畜禽和水产养殖行业，其对于革兰氏菌、真菌和一些原虫引起的疾病具有显著疗效[1]。但是有研究表明，硝基呋喃类化合物及其代谢产物具有致畸等副作用，且能诱发癌症[2-3]。1993年，美国禁止呋喃唑酮作为兽药使用在食品动物[4]。1995年，欧盟全面禁止使用呋喃类抗菌药，规定呋喃类残留物在动物源性食品中不得检出[5]。2004年，美国食品和药品管理局(FDA)公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮[6]。中国农业部第193号公告已明令禁止在食用动物上使用呋喃唑酮、硝呋烯腙等硝基呋喃类药物。常见的硝基呋喃类药物包括呋喃唑酮(Furazolidone，FZD)、呋喃西林(Nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(Nitrofurantion，NFT)、呋喃它酮(Furaltadone，FTD)、硝呋齐特(Nifuroxazide，NFX)、硝呋吡醇(Nifurprinol，NFP)、硝呋索尔(Nifursol，NFS)、硝呋烯腙(Nitrovin，NTV)和二硝托胺(Dinitolmide，DTM)等。

串联四极杆质谱仪具有检测灵敏度高，特异性强，稳定性好等优点[6]，其优秀的定性与定量分析能力目前已被广泛应用于蛋白质组学、中药安全控制、代谢组学、和食品安全领域中小分子和大分子的研究[7-10]。据文献报道[11]，有使用高效液相色谱法检测饲料中多种硝基呋喃类药物，其定量限达到0.5 mg/kg；动物性食品中则主要使用串联四级杆质谱检测4种硝基呋喃代谢物的残留量，而利用串联质谱的正负切换功能同时定性定量测定饲料中10种违法添加的硝基呋喃类抗菌药物的方法未见报道。本研究利用高效液相色谱-串联四极杆质谱的高灵敏度和定性能力，实现了饲料中10种非法添加的硝基呋喃类化学药物快速定性与定量测定。本方法具有前处理过程简便、分析时间短、结果准确等特点，可以用于饲料中非法添加的硝基呋喃类药物的筛查与定量。

1 材料与方法

1.1 仪器 Ultimate 3000双三元超高效液相色谱、Excalibur控制软件、串联四极杆质谱带HESI电离喷雾源(TSQ Quantiva)、Xcalibur数据处理系统、高速冷冻离心机(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；减压旋转蒸发仪(B-490，BUCHI)；水浴控温氮吹仪(N-EVAP，上海安谱公司)。

1.2 材料、药品与试剂 C18分析柱(Hypersil gold C18 150×3.0mm 3.0 μm，Thermo Fisher，美国)；高速冷冻离心机(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER，美国)；水浴控温氮吹仪(N-EVAP，Anpel)。呋喃唑酮(Furazolidone，FZD)、呋喃西林(Nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(Nitrofurantion，NFT)、呋喃它酮(Furaltadone，FTD)、硝呋齐特(Nifuroxazide，NFXD)、硝呋吡醇(Nifurprinol，NFP)、硝呋索尔(Nifursol，NFS)、硝呋烯腙(Nitrovin，NTV)、硝呋醛肟(Nifuroxime，NFXM)和二硝托胺(Dinitolamide，DTM)(≥99.0%，Dr Ehrenstofer GmbH，德国)；乙腈、甲酸(色谱纯，Merk，德国)；去离子水(自制，电阻率≥18 MΩ·cm)；高纯氮、高纯氩(纯度均为99.999%，上海佳杰特种气体公司)。

1.3 反相色谱条件 色谱柱：Hypersil gold C18 (150×2.1 mm 1.9 μm)，柱温：30 ℃，流速：0.3 mL/min,进样量：10 μL，流动相：A为0.1%甲酸，B为乙腈，采用梯度洗脱程序如表1，所得典型特征离子质量色谱图如图1。

表1 反相色谱法梯度洗脱程序Tab 1 Procedure of reverse-phase chromatography

图1 定量限浓度典型SRM图Fig 1 Typical SRM chromatogram of LOQ

1.4 质谱条件 使用Thermo Fisher公司的TSQ Quantiva串联四极杆质谱带HESI电离喷雾源质谱检测器对1 μg/mL的10种硝基呋喃类药物单标溶液进行优化， 兼顾各目标化合物优化后的质谱条件为：选择正负离子切换模式，正电压3900 V，负电压3200V，鞘气(Sheath gas)压力344 kPa，辅助气(Aux gas)流速5 L/min，吹扫气(Sweep gas)流速0.3 L/min，离子传输管(Ion transfer tube)温度350 ℃，雾化器(Vapourizer)温度400 ℃，检测模式为选择反应监控(Selected reaction monitor，SRM)，碰撞气压力0.2 Pa，Q1段分辨率设为半峰宽0.7，Q2段分辨率设为半峰宽0.7，10种硝基呋喃类药物的定性与定量离子对以及对应的撞击能量见表2。

表2 硝基呋喃类药物定性与定量离子对Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair of nitrofurans

*为定量离子

1.5 前处理条件 取样品2.00 g，置50 mL离心管中，加入20 mL的0.1 mol/mL HCl∶乙腈=1∶1溶液后30 ℃水浴超声提取10 min，然后经9000 RPM高速离心后取上清液0.20 mL，用0.1 mol/L甲酸水溶液稀释至1.00 mL，加入酸性氧化铝粉末0.20 g涡旋振荡1 min，经14000 RPM离心后取上清液过0.22 μm尼龙滤膜后上机测定。

2 结 果

2.1 线性定量范围的确定 将10种硝基呋喃类化合物对照品分别用甲醇溶解，制成1 μg/mL的标准品贮备液，取适量该贮备液用0.1 mol/L甲酸溶液稀释成标准曲线系列工作溶液，将该系列溶液依次按1.3、1.4和1.5的检测方法进样检测，将所得定量通道色谱图积分后面积与内标峰面积比值以Y表示，进样浓度以X表示，所得回归曲线结果如下表3所示，其线性相关系数r都大于等于0.995。实验表明，该方法同时检测10种硝基呋喃类化合物在各自浓度范围内线性良好。

表3 10种硝基呋喃类化合物标准曲线Tab 3 Standard curve of 10 nitrofurans

2.2 检测限与定量限的确定 选择20个空白样品，按优化条件进行处理后上机测定，取与标准品图谱中相同保留时间的噪音信号平均值，以信噪比S/N≥3为检出限(LOD)，S/N≥10为定量下限(LOQ)，确定该方法对的检出限与定量限，见表4。经过实际进样检测后，检测定量限附近峰型良好，实际样品定量限处SRM图谱见图1。

2.3 基质效应的考察 为验证方法基质效应，选取预混料、浓缩料和配合料各6批，按1.5前处理方法进行操作，将其空白溶液中分别加入1倍定量限的10种硝基呋喃类化合物，其回收率结果在80%～100%之间，RSDlt;10%，证明该前处理方法的基质效应影响不大。

2.4 方法准确度与精密度实验 为验证方法精密度与准确度，采用标准添加法使用6批不同饲料，

表4 10种硝基呋喃类化合物检测限和定量限Tab 4 LOD and LOQ of 10 nirtofurans

每批称取等量6份，5份一组分三组，分别加入1倍定量限、2倍定量限、4倍定量限的10种硝基呋喃类化合物，所得结果如表5所示。结果表明，该方法检测饲料中10种硝基呋喃类化合物时回收率结果在63.2%～89.7%之间，RSDlt;10%，证明该方法具有较高的准确度与精密度。

表5 饲料中检测10种硝基呋喃类化合物的准确度和精密度Tab 5 Accuracy and precision of 10 nirtofurans in feed

2.5 方法选择性的验证 选择20个空白样品，按优化条件进行处理后上机测定，未发现有假阳性结果，表明该方法的选择性良好。

3 讨论与小结

3.1 固定相的选择 方法涉及的目标化合物较多，而且还涉及到不同电离极性的切换，因此使目标化合物获得充分的保留与分离就十分有必要。通过选择具有更好保留性和选择性的色谱柱优化色谱条件，既可以避免强极性的保留杂质与目标化合物分子争夺电荷抑制响应信号，也可以将分子量接近的化合物尽可能分开避免互相干扰。本实验尝试了亲水合相色谱(HILIC)和传统的反相色谱(RP)两种思路的方法，目标化合物大多呈中弱极性，在HILIC色谱上的保留普遍较弱，且峰型展宽严重，在RP色谱柱上有较好的保留，因此选择传统的反相色谱作为主要分离手段。尝试了同为Thermo公司装填的三款反相色谱柱：Accucore RP-MS (150 mm×2.1 mm,2.6 μm)，Syncronis C18 (150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)和Hypersil Gold C18 (150 mm×2.1 mm,1.9 μm)。结果表明，使用Accucore RP-MS色谱柱的目标物峰普遍具有保留时间不足，峰型对称性不高的特点，推测其原因为所使用的聚合物性质填料含碳量接近10%，虽然通过壳层技术增加了填料的比表面积，但并不能提供很好的保留；Syncronis C18色谱柱的硅胶键合填料含碳量接近17%，因此为目标化合物提供了足够的保留，但是其中有多个目标化合物的色谱峰出现了较大的拖尾，其中硝呋索尔和硝呋吡醇尤为严重，推测是因为色谱柱的硅胶键合相具有较多的硅羟基，容易和化合物的相应位点形成氢键效应而造成色谱峰的展宽和拖尾；Hypersil Gold C18色谱柱所使用的硅胶载体经过了纯化工艺和末端封尾，大大降低了硅羟基的数目，虽然担体含碳量不及Syncronis C18高，但是1.9 μm的填料粒径为其提供了比3.0 μm多2倍以上的比表面积，因此对大多数目标化合物既能获得较满意的保留时间，也能确保色谱峰的展宽和拖尾在令人满意的程度。

3.2 正负电离模式切换研究 随着检测技术的发展，对检测过程的时效性也提出了更高的要求，色谱质谱联用法为药物残留检测提供了一条同时兼顾准确定性与精确定量的途径。目前串联四级杆质谱仪的扫描精度和扫描速度相较过去有了长足进步，同时前端源区通过一些先进技术也大大提高了检测灵敏度，这就为单针进样检测更多的化合物提供了硬件基础，由于质谱内电场极性的切换可以在万分之一秒内完成，因此这就为正负极性快速切换检测提供了可能性。本方法内涉及的多个药物在正负电离模式下都可以获得带电分子离子如硝呋醛肟和二硝托胺，其负电离模式下所获得的响应信号更高，推测可能是其分子结构更容易失去质子而带负电核，而呋喃妥因则是在正电离模式下几乎没有响应，可能其分子结构很难通过获得质子而带正电荷。利用Quantivia质谱仪可以高速切换电场和扫描频率的特点，将10种硝基呋喃类化合物通过正负电离模式的快速切换可以实现在单针内的快速检测。结果表明，这种正负电离模式的切换在本方法中是可行的，可以大大提高检测的时效性。

3.3 小结 利用串联四级杆质谱具有可以快速切换电场极性和高速扫描的特点，设计了单针同时检测10种硝基呋喃类化合物的方法，前处理采用简单的酸性乙腈提取，酸性氧化铝粉末净化后稀释进样，反相色谱法进行分离。实验结果表明，10种硝基呋喃化合物在各自线性定量范围内回收率也可达到63.2%～89.7% ，相对标准偏差(RSD)小于9.3%，方法具有简便、快速、灵敏、准确等特点，适用于饲料中违法添加硝基呋喃类化合物的检测。

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(编辑：陈希)

Determinationof10NitrofuransinFeedbyHighPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometrywithPositiveandNegativeSwitching

WU Jian-ping, ZHANG Jing, LI Dan-ni*, YAN Feng, PAN Juan

(ShanghaiMunicipalSupervisoryInstituteVeterinaryDrugsandFeedstaff,Shanghai201103,China)

LIDan-ni,E-mail:yure@sina.com

To determine the illegal added 10 nitrofuranes in feed, a high performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry method was established. Feed was extracted by 0.1 mol/mL HCl∶acetonitrile=1∶1. The extraction was high speed centrifuged and purified by acid then diluted to inject. Thermo Hypersil Gold C18 column (150 mm×2.1 mm, 1.9 μm) was chosen to be the solid phase and 0.1% formic acid combined with acetonitrile were chosen to be the liquid phase to achieve the grad elution. The mass spectrometer was operated using positive and negative switching under SRM mode. Under the optimal conditions, 10 nitrofuranes were separated well. Good linearity was obtained in their respective quantitative range (correlation coefficientsr≥0.99). The average recoveries were in the range of 63.2%～89.7% and the relative standard deviations (RSD) were lower than 9.3%. The method was proved to be convenient, economical, sensitive and accurate. The research was proved to be effective for the detemination of the illegal added 10 nitrofuranes in feed.

10 nitrofurans; positive and negative switching; tandem mass spectrometry

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.08

2017-02-07

A

1002-1280 (2017) 11-0051-08

S859.84

上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2016)第4-5号]；上海市市级农口系统青年人才成长计划[沪农青字(2016) 第2-5号]

吴剑平，硕士，畜牧师，从事兽药残留分析与研究。

李丹妮。E-mail: yure@sina.com