马明福 江彤 马兰 马生花

青藏高原藏族人群Graves病与CTLA-4基因多态性及炎症因子的相关性研究

马明福1江彤1马兰2马生花1

目的探讨青藏高原藏族人群Graves病（GD）与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA-4）基因多态性及炎症因子的相关性。方法以96例世居于海拔3 000米以上的GD患者为研究对象纳入观察组，选择同期90例世居于海拔3 000米以上的健康体检者纳入对照组A，90例世居于海拔2 200米健康体检者纳入对照组B，对三组对受试者CTLA-4基因多态性及血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平与三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）水平的相关性进行观察。结果观察组CTLA-4基因1+49 A/G位点G/G基因型频率及G等位基因频率高于对照组A及B，A/A基因型频率及A等位基因频率明显低于对照组A和对照组B（P＜0．05）；IL-6及TNF-α水平均与FT3、FT4呈正相关（P＜0．05）。结论CTLA-4外显子1+49位点的多态性可能与青海藏族GD患者疾病的发生存在一定相关，炎性因子水平检测可能对GD病情的诊断及治疗效果的判断有一定指导意义。

藏族；高原；Graves病；CTLA-4基因多态性；炎症因子

毒性弥漫性甲状腺肿又称Graves病（GD）属于自身免疫性疾病[1]。目前Graves病发病机制尚未明确，体液免疫及细胞免疫缺陷是目前公认的致病因素。熊晓亮等[2]指出GD患者外周血中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎性因子水平显著高于正常人群，提示GD免疫学发病机制与IL-6、TNF-α水平异常升高存在一定相关性。随着研究的深入，近年来大量证据表明细胞毒性T淋巴细胞相关抗原（CTLA-4）基因多态性与GD有重要关系，但多数研究以平原地区汉族人群作为研究对象，而对高原地区藏族人群GD与CTLA-4基因多态性的关系鲜有报道[3]。本研究探讨青藏高原世居藏族人群Graves病与CTLA-4基因多态性及炎性因子水平的相关性，旨在为针对性的预防和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年9月—2016年12月青海大学附属医院门诊就诊的96例GD患者为研究对象，纳入观察组。纳入标准：符合人民卫生出版社出版的《内科学（第八版）》[4]中GD的相应诊断标准；藏族；居住环境：果洛、玉树、海南等海拔3 000米以上的高寒、缺氧地区；受试者间均无亲缘关系。选取同期于青海大学附属医院健康体检者90例（世居果洛、玉树、海南等海拔3 000米以上的高寒、缺氧地区的藏族健康人群），纳入对照组A；及90例健康体检者（世居于海拔2 200米的西宁地区的健康藏族人群）纳入对照组B。三组均排除患有其他甲状腺疾病及1型糖尿病、白癜风等自身免疫性疾病者。观察组中，男24例、女72例，平均年龄为（39.65±14.36）岁；对照组A中，男22例、女68例，平均年龄为（40.23±16.42）岁。对照组B中，男21例、女69例；平均年龄为（40.02±17.42）岁。三组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。研究方案经青海大学附属医院伦理委员会同意并征得研究对象的同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血提取 所有受试者均于空腹状态下抽取肘静脉血10 ml，采用乙二胺四乙酸抗凝后，50%经离心处理（转速3 000 r/min，时间10 min）后分装血浆及血细胞，于-80℃条件下冷冻保存，备用；50%经离心处理（转速4 000 r/min，时间10 min）后将血清置于EP管中，于-80℃条件下冷冻保存，备用。

1.2.2 甲状腺功能测定 采用放射性免疫法测定三组受试者甲状腺功能（青海大学附属医院核医学科），包括游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）及游离甲状腺素（FT4）。

1.2.3 TNF-α和IL-6水平测定 采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）对三组受试者血清TNF-α及IL-6水平进行检测，试剂盒购自美国R＆D公司，具体检测步骤严格按照试剂盒说明进行操作。

1.2.4 CTLA-4基因多态性检测 （1）外周血基因组DNA提取：观察组和对照组A所有观察对象抽取外周静脉血，取1 ml置于ED-TA抗凝试管，30 min内离心（3 000 rpm，10 min），分装血浆和血细胞，-80℃冰箱保存。按常规实验步骤提取外周血基因组DNA。

（2）聚合酶链式反应扩增：提取三组受试者外周血基因组DNA，选用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术进行检测。根据美国国家生物技术信息中心所建立的DNA序列数据库进行引物设计及合成。CTLA-4DNA序列设计两对聚合酶链反应引物，外显子1+49 A/G多态性上游引物（5'-GCTCTACT TCCTGAAGACCT-3'）和下游引物（5'-AGTCTCACTCACCTTTGCAG-3'），随后启动子-318C/T多态性上游引物（5'-AAATGAATTG-GACTGGATGGT-3'）和下游引物（5'-TTAC GAGAAAG-GAAGCCGTG-3'）。取目的基因 10 μl行聚合酶链扩增反应。反应条件：于95℃预变性后（时间2 min），根据以下程序进行循环，共40次：①95℃变性20 s；②65℃退火0.5 min，72℃延伸0.5 min。末次循环后结束反应（于72℃延伸10 min，置于4℃18 h）。分别取4 μl三组聚合酶链式反应产物，在80 V条件下，经1%琼脂糖凝胶电泳进行分离，选用美国可达Digital2 Science System DC2120凝胶成像系统进行扫描成像。

（3）限制性内切酶反应：选用纽英伦生物技术（北京）有限公司提供的限制性内切酶Bbv I，于37℃条件下进行温育16 h，取出后改为水浴（反应体系总体积20 μl，包括10×NE Buffer 2 μl，DNA16 μl，内切酶 0.5 μl，无菌去离子水 1.5 μl）65℃，20 min终止反应。酶切产物采用 2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，经紫外线检测凝胶成像系统成像。再经BbvⅠ内切酶处理后行3%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统扫描。

1.3 观察指标

（1）对三组受试者A/A、A/G、G/G基因型和A、G等位基因出现频率进行观察比较；（2）观察三组患者血清TNF-α、IL-6水平及FT3、FT4水平，并分析与青藏高原世居藏族人群Graves病发生的相关性。

1.4 统计学方法

选用Excel软件对本研究所得数据进行归纳、整理，选用SPSS 11.5 for Windows软件进行统计分析，等位基因频率以直接计算法进行统计。计量资料采用（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料采用（%）表示，率的比较采用χ2检验，采用Spearman检验进行相关性分析，检验水准α值取双侧0.05。

2 结果

2.1 三组受试者CTLA-4基因多态性比较

经Hardy-Weinberg 平衡检验结果显示，观察组具有群体代表性。对照组A与对照组B CTLA-4基因1+49 A/G位点A/A、A/G、G/G基因型频率及A、G等位基因频率比较，差异均无统计学意义（χ2A/A= 0.03，χ2A/G=0.02，χ2G/G=0.00，χ2A=0.08，χ2G=0.08，P＞0.05）；而观察组CTLA-4基因1+49 A/G位点G/G基因型频率及G等位基因频率高于对照组A及对照组B，A/A基因型频率及A等位基因频率低于对照组A与B，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 三组受试者CTLA-4基因多态性比较 [n（%）]

2.2 Graves病与炎性因子水平的相关性

观察组各项指标水平均高于对照组A，差异均具有统计学意义（P＜0.01），见表2。IL-6及TNF-α水平均与FT3、FT4呈正相关，见表3。

表2 两组炎症因子及甲状腺功能指标水平（±s）

表2 两组炎症因子及甲状腺功能指标水平（±s）

观察组 1.98±0.26 3.96±0.84 17.54±6.13 61.03±14.27对照组A 1.51±0.18 1.52±0.76 4.26±0.57 16.38±6.49 t值 11.52 20.73 20.47 27.16 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 Graves病与炎性因子水平的相关性

3 讨论

GD多在环境、药物等不良刺激下，诱发机体内免疫功能紊乱，致使出现甲状腺肿大、皮损等临床症状[5]。有研究指出，青海高寒、低氧地区人群GD发病率较高，尤其女性发病率明显高于海拔较低的西宁等地区[6]。由于部分人群居住分散，医疗条件差，疾病知晓率、就诊率均较低，往往容易错过最佳治疗时机，影响身心健康。GD发病因素主要有遗传因素、环境因素、自身免疫三类，其中自身免疫机制尚未完全明确，目前认为主要机制是甲状腺自身抗原和抗体在CTLA-4、白介素、TNF-α等参与下发生自身免疫反应；当个体CTLA-4基因中的3’-UTR9（AT）n呈现为最短等位基因时，能够使机体内表达高水平的CTLA-4，从而保护机体免于出现自身免疫性疾病；而当个体3’-UTR9（AT）n部位呈现出较长等位基因时，体内CTLA-4 mRNA的稳定性降低，甚至降解迅速，致使CTLA-4表达水平下降，增加自身免疫性疾病的发生率。GD易导致甲状腺眼病等相关疾病的发生，张晓英[7]等人的研究指出，青海高原、低氧地区甲状腺眼病与CTLA-4外显子1+49基因位点的多态性存在着明显关联，但未有针对藏族GD患者与CTLA-4基因多态性相关性的研究。

FT3、FT4是诊断甲状腺功能亢进的关键性指标，这两项指标水平与疾病的发生及发展呈现出正相关性[8]。本研究结果显示，观察组CTLA-4基因1+49 A/G位点G/G基因型频率及G等位基因频率高于对照组A及对照组B，A/A基因型频率及A等位基因频率低于两组对照组；而IL-6及TNF-α水平均与FT3、FT4呈正相关（P＜0.05）。提示，IL-6及TNF-α水平的增高可能与青海高海拔地区GD的发生和发展存在一定关系。

综上所述，CTLA-4外显子1+49位点的多态性可能与青海藏族GD患者疾病的发生存在一定相关，炎性因子水平检测可能对GD病情的诊断及治疗效果的判断有一定指导意义。

[1]上官兆水，陈超，张惠杰，等．白介素-23受体基因多态性与Graves病相关性研究[J]．中国实用内科杂志，2013，33（1）：52-54．

[2]熊晓亮，白金锡，刘颖，等．Graves病患者细胞因子水平的变化[J]．中国老年学杂志，2014，34（22）：6541-6542．

[3]孙涛，侯海峰，李群伟，等．中国人群CTLA-4基因第49位点和CT60位点多态性与毒性弥漫性甲状腺肿相关性的Meta分析[J]．中国预防医学杂志，2016，17（7）：481-485．

[4]葛均波，徐永健．内科学[M]．8版．北京：人民卫生出版社，2013：842-845．

[5]秦静，李玉姝，滕卫平．Graves病与甲状腺癌关系研究进展[J]．中国实用内科杂志，2015，35（4）：367-369．

[6]王淑琼，罗玮，姚勇利，等．青海汉族Graves病甲状腺肿大与CTLA-4 基因多态性相关性研究 [J]．实用预防医学，2015，22（9）：1136-1138．

[7]张晓英，李凌．2010～2014年青海省高原地区甲状腺眼病和CTLA-4基因多态性的相关性研究调查[J]．中国地方病防治杂志，2016，31（4）：382-384，388．

[8]高书莲．FT3、FT4、TSH与T3、T4联检评价甲状腺功能的临床意义 [J]．中国当代医药，2013，20（13）：98-99．

Correlative Relationship Between Graves Disease and CTLA-4 Gene Polymorphism and Inflammatory Factors in Tibetan Population of Qinghai-Tibet Plateau

MA Mingfu1 JIANG Tong1 MA Lan2 MA Shenghua1 1 Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining Qinghai 810000, China; 2 Qinghai Plateau Medical Center, Xining Qinghai 810000, China

ObjectiveTo observe the correlative relationship between Graves disease (GD) and CTLA-4 gene polymorphism and inflammatory factors in Tibetan population of Qinghai-Tibet plateau.MethodsThe study group: 96 cases of GD patients over 3 000 meters above sea level over 3 000 meters above sea level; The control group A: 90 cases of high altitude Tibetan health volunteers on 2 200 meters above sea level; The control group B: 90 cases of low altitude healthy volunteers. Three groups of CTLA-4 gene polymorphisms and the correlation between TNF-α and IL-6 levels and FT3and FT4levels were observed.ResultsThe frequencies of G/G genotype and G allele of CTLA-4 gene 1+49 in observation group were significantly higher than control group A and B, A/A genotype frequency and A allele frequency were significantly lower than the control group A and B (P＜0.05); IL-6 and TNF-α levels were positively correlated with FT3and FT4(P＜0.05).ConclusionPolymorphism of exon 1+49 locus of CTLA-4 may be related to the occurrence of disease in Qinghai Tibetan GD patients, the detection of inflammatory factor may be helpful in the diagnosis and treatment of GD disease.

Tibetan; plateau; Graves disease; prognosis; CTLA-4 gene polymorphism

R581

A

1674-9308（2017）25-0032-03

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．25．017

1 青海大学附属医院内分泌科，青海 西宁 810000；2 青海高原医学中心，青海 西宁 810000