武晓琳 赵春燕 江海洋 范聪聪 王丽波

吉林大学基础医学院病原微生物学系1(130021) 吉林大学第一医院胃肠内科2

实验性结肠炎大鼠结肠上皮claudin-1、-2、-4表达改变*

武晓琳1赵春燕1江海洋1范聪聪1王丽波2#

吉林大学基础医学院病原微生物学系1(130021)吉林大学第一医院胃肠内科2

紧密连接蛋白质类； 恶唑酮； 结肠炎,溃疡性； 细胞因子类

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一组反复发作的慢性炎症性肠道疾病，影响包括儿童在内的几乎各个年龄段的人群，已成为全球性疾病[1]。然而，其病因尚未完全阐明，目前普遍认为UC的致病因素可能包括遗传、免疫异常、环境、肠道微生物等的相互作用，最终导致结肠炎症的发生[2]。肠黏膜屏障受损可能是导致UC发生的病理基础。近年发现位于上皮细胞顶侧的紧密连接改变在肠道屏障功能中发挥关键作用，紧密连接主要由claudin蛋白、occuludin蛋白、JAM等结构蛋白分子共同组成[3]。来源于植物或水果的提取物(如姜黄素、槲皮素、苹果原浆等)已在Caco-2细胞株中证实可通过抑制激酶或促使转录因子表达来调节claudin表达，从而增加跨上皮电阻，改善肠上皮屏障功能。上述实验结论可能延伸到人小肠上皮，从而对肠相关疾病的研究起积极作用[4-6]。目前claudin在UC病因、诊断、预后以及治疗中的分子机制研究少见。本研究通过给予恶唑酮诱导大鼠实验性结肠炎模型，并检测claudin蛋白表达，旨在探讨紧密连接在UC中的作用，从而为其用于UC的诊治提供一定的依据。

材料与方法

一、主要材料

清洁级雌性Wistar大鼠(吉林大学动物实验中心)40只，体质量180～210 g。恶唑酮购自Sigma公司；claudin-1兔多克隆抗体购自ImmunoWay公司；claudin-2兔多克隆抗体购自Abcam公司；claudin-4山羊多克隆抗体购自Santa Cruz公司；GAPDH鼠单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；RNAiso Plus试剂盒、SuperPrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Erase试剂盒和SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase均购自TaRaKa公司；IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α大鼠ELISA检测试剂盒均购自R&D公司。

二、研究方法

1.动物分组与造模方法：按照Abdin[7]的实验方法，将大鼠分为模型组和正常对照组，每组各20只。大鼠禁食不禁水1 d，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，将一直径2 mm的静脉输液管由肛门轻缓插入至8 cm处，模型组大鼠注射浓度为7.5 mg/mL的恶唑酮1.1 mL，正常对照组注射等体积0.9% NaCl溶液，倒置1 min，以利药物与肠壁充分接触而不致于经肛门溢出。结束后，动物平躺，自然清醒，自由饮食。每日观察并记录各组大鼠存活状况，精神状态、进食、活动、排便等情况。

2.标本采集：造模后第7天，10%水合氯醛麻醉大鼠，取结肠组织。部分结肠组织以4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，行HE染色和免疫组化染色，剩余结肠组织置于液氮中保存，用于实时PCR和蛋白质印迹法。

3.观察指标：①造模后存活率：主要观察模型组大鼠死亡情况。②造模后一般情况：包括大鼠饮食、体质量、排便、皮毛、活动情况、精神状态等情况。③造模后结肠组织损伤大体形态评分和组织学评分方法：大体评分指标包括黏连、局部充血、溃疡和炎症。黏连和充血按有无以及轻重程度分别计0、1、2分，出现炎症、溃疡数目增加1个、溃疡直径>2 cm时每增加1 cm计分均加1分。组织学评分指标包括溃疡、炎症、肉芽肿、纤维化以及病变深度，按有无和轻重程度分别计0、1、2分，病变深度达黏膜下层、肌层、浆膜层分别计1、2、3分，各项相加得总评分。④HE染色：光学显微镜下观察组织炎症和溃疡情况。

4.ELISA法：取各组大鼠血清和结肠组织，按照ELISA试剂盒说明书，设置标记标准孔和样品孔后分别加入待测样本10 μL、样本稀释液40 μL以及检测抗体100 μL，封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱孵育1 h，清洗反应板。每孔先后加入底物A、B各 50 μL，37 ℃避光孵育15 min。最后加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔A值。

5.免疫组化染色：取各组大鼠结肠组织切片二甲苯脱蜡，3% H2O2孵育30 min以阻断内源性过氧化氢酶，PBS洗涤，1% BSA封闭30 min后滴加一抗(claudin-1、-2、-4工作浓度分别为1∶100、1∶300、1∶200)，4 ℃过夜，PBS洗涤，加入二抗。DAB显色，苏木素复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察。以细胞质呈棕黄色或棕褐色为阳性表达。

6.实时PCR法：提取结肠组织总RNA，逆转录合成cDNA。各目的基因的引物序列见表1，反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，40个循环。上CFX 96TMRealTime System(Bio-Rad)荧光定量仪，具体步骤按照说明书进行。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法分析样本中目的基因mRNA相对表达量。

7.蛋白质印迹法：提取结肠组织全蛋白并测定蛋白含量。取60 μg蛋白行SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜上，加入抗claudin-1抗体(工作浓度1∶200)、抗claudin-2抗体(工作浓度1∶300)、抗claudin-4抗体(工作浓度1∶200)4 ℃过夜，次日用TBST洗涤3次，加入二抗孵育1 h，化学发光ECL放射自显影。以GAPDH作为内参，Image J软件处理分析蛋白条带灰度值。

表1 目的基因引物序列

三、统计学分析

结 果

一、大鼠一般情况

模型组大鼠3 d内出现排便次数增多、稀便、便上有黏液或脓点、肛周有粪便等表现，少数出现黏液血便，其中4只大鼠因症状严重而于造模3 d左右死亡。死亡大鼠腹腔内可见大量腹水，胃腔高度扩张，空回肠亦明显扩张，结直肠水肿、肠壁颜色灰暗，肠壁变薄，部分呈坏疽状，其中1只可见穿孔灶(图1)。正常对照组大鼠饮食正常、反应灵活、体质量增加，毛发无光泽，大小便正常均无腹泻和血便。

二、组织病理学改变

模型组大鼠结肠黏膜上皮糜烂、溃疡形成，黏膜下水肿、杯状细胞和腺体减少，固有层有弥漫性中性粒细胞、淋巴细胞浸润，黏膜下淋巴细胞增生；正常对照组结肠黏膜上皮完整，黏膜下亦无腺体和杯状细胞消失，仅见少量炎症细胞浸润(图2)。模型组大体评分和结肠组织学评分明显高于对照组(P<0.05)(表2)。

三、血清和结肠组织细胞因子含量

与正常对照组大鼠相比，模型组血清和结肠组织IL-4和IL-5含量均显著增高(P<0.05)，而两组TNF-α和IL-10含量无明显差异(P>0.05)(表3、表4)。

图1 模型组死亡大鼠大体表现图

表2 大鼠结肠组织学评分比较

*与正常对照组比较，P<0.05

图2 各组大鼠结肠组织HE染色图

四、紧密连接蛋白claudin分布和表达

免疫组化结果显示，claudin-1、-2、-4在正常对照组以及模型组大鼠结肠上皮中均有不同程度的表达，主要位于细胞质。与正常对照组相比，模型组大鼠结肠组织中claudin-1、-4表达明显下降，而claudin-2表达明显增加(图3)。

表3 各组大鼠血清细胞因子含量比较

表4 各组大鼠结肠组织细胞因子表达比较

图3各组大鼠结肠组织中claudin-1、-2、-4表达(免疫组化染色，×200)

五、实时定量PCR检测claudin-1、-2、-4 mRNA表达

与正常对照组相比，模型组claudin-1、-4 mRNA表达显著降低(P<0.05)，而claudin-2 mRNA表达显著增高(P<0.05)(图4)。

六、蛋白质印迹法检测claudin-1、-2、-4蛋白表达

与正常对照组相比，模型组claudin-1、-4蛋白表达显著降低(P<0.05)，而claudin-2蛋白表达显著增高(P<0.05)(图5)。

*与正常对照组比较，P<0.05

图4各组大鼠结肠组织中claudin-1、-2、-4 mRNA表达(实时PCR法)

1 Da=0.992 1 u

图5各组大鼠结肠组织中claudin-1、-2、-4蛋白表达(蛋白质印迹法)

讨 论

近年肠黏膜屏障功能在IBD病理生理过程中的作用逐渐引起重视。机械屏障是肠黏膜屏障的重要组成部分，由单层肠上皮细胞和细胞间连接(包括紧密连接、黏附连接和缝隙连接)组成，紧密连接通透性是决定肠道通透性的关键因素，维持完整的紧密连接形态和功能对保护肠黏膜屏障、防止细菌易位具有重要意义。急性期IBD患者肠黏膜屏障受损，肠道通透性增加，肠上皮完整性受损，如溃疡、糜烂等肉眼可见病变是引起屏障功能受损的主要原因，但在上皮组织完整的肠黏膜区同样可见紧密连接结构受损、通透性增加[8]。

细胞因子通过两种方式影响紧密连接，一是调节紧密连接蛋白的表达，二是影响紧密连接蛋白重新分布的过程[9]。恶唑酮为一种半抗原，可诱发大鼠结肠发生接触性过敏反应。恶唑酮诱导的实验性结肠炎为IL-4介导的以IL-4/IL-5含量增高为主、TNF-α和INF-γ含量正常的典型Th2型炎症。本研究中，与正常对照组相比，模型组大鼠血清以及结肠组织促炎细胞因子IL-4和IL-5表达显著增高，而TNF-ɑ和IL-10表达无明显差异。但UC发病过程中涉及多种细胞因子，如促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17、IL-23、IFN均与UC的发病和进展密切相关，而抗炎细胞因子如IL-4、IL-10和IL-13与UC的发病以及病理特征密切相关，促炎因子和抗炎因子共同影响结肠黏膜炎症的发生、发展，因此各细胞因子在恶唑酮诱导UC中的作用仍需进一步研究。

紧密连接复合体由occludin、claudin以及膜周蛋白JAM和ZO蛋白以及相关激酶组成。Claudin蛋白是组成紧密连接复合体的功能和结构基础，可直接影响上皮/内皮组织跨上皮细胞电阻，决定紧密连接复合体的离子选择性，并调节紧密连接复合体的通透性。一部分claudin可加固细胞间的连接，其表达上调可降低紧密连接复合体的通透性，称之为“封闭性”claudin蛋白，包括claudin-1、-3、-4、-5、-8等；另一部分claudin分子可通过形成特异性离子通道而增加紧密连接复合体的通透性，称之为“渗漏性”claudin蛋白，如claudin-2可增加紧密连接结构孔数量，增加经细胞旁物质运输，尤其是Na+离子的吸收。claudin蛋白与occludin、ZO蛋白相连，在组装成熟的紧密连接结构和维持紧密连接复合体的完整性方面发挥重要作用[9]。

本研究免疫组化、蛋白质印迹法和实时PCR结果均显示，与正常对照组相比，恶唑酮诱导的结肠炎大鼠结肠上皮渗漏性紧密连接蛋白claudin-2表达增加，封闭性紧密连接蛋白claudin-1、-4表达显著下降。推测这些紧密连接蛋白表达变化是引起恶唑酮大鼠结肠紧密连接复合体受损、肠黏膜屏障功能下降的主要机制。Fischer等[10]的研究表明TNF-α单克隆抗体阿达木单抗可缓解TNF-α引起的结肠癌细胞株T-84细胞紧密连接蛋白claudin-1、-2、-4以及occludin表达减少导致的细胞屏障功能紊乱以及渗透性增加。因此细胞屏障的保护作用将成为抗TNF-α治疗机制的研究新方向，这一作用可对炎症性肠病造成的结肠上皮重塑以及组织损伤均具有重要意义[11]。

总之，结肠炎大鼠结肠组织中claudin-1、-2、-4表达改变与黏膜屏障损伤、功能紊乱以及渗透性改变可能具有重要联系，可作为UC的治疗研究靶点，是UC药物治疗疗效的重要评价指标以及药物机制研究的重要方向，未来需行进一步研究探讨。

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(2017-05-17收稿；2017-07-01修回)

ChangesofExpressionsofClaudin-1,-2,-4inExperimentalColitisRats

WUXiaolin1,ZHAOChunyan1,JIANGHaiyang1,FANCongcong1,WANGLibo2.

1DepartmentofPathogenBiology,CollegeofBasicMedicalSciences,JilinUniversity,Changchun(130021);2DepartmentofGastroenterology,theFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun

WANG Libo,Email:wanglibo75@163.com

Claudins; Oxazolone; Colitis,Ulcerative; Cytokines

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.005

吉林省科技发展项目计划(20130413011GH)

#本文通信作者，Email:wanglibo75@163.com

背景：溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎症病变，大量研究表明，UC肠黏膜损伤与紧密连接蛋白改变有关。目的探讨实验性结肠炎大鼠结肠中claudin-1、-2、-4的表达。方法将40只雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组和模型组，给予大鼠7.5 mg/mL恶唑酮灌肠制备实验性结肠炎模型，以等量0.9% NaCl溶液灌肠作为正常对照。造模7 d后，行大体评分和结肠组织学评分，以ELISA法检测血清和结肠中细胞因子TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10含量，免疫组化和蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白claudin-1、-2、-4蛋白表达，实时PCR法检测claudin-1、-2、-4 mRNA表达。结果与正常对照组相比，模型组结肠大体评分和组织学评分均显著升高(P<0.05)；血清和结肠组织IL-4和IL-5含量均显著增高(P<0.05)，而两组TNF-α和IL-10含量无明显差异(P>0.05)；claudin-1、-4 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)，claudin-2 mRNA和蛋白表达显著增高(P<0.05)。结论实验性结肠炎大鼠中紧密连接蛋白claudin-1、-2、-4的分布和表达发生改变，导致肠黏膜屏障功能受损，有望作为UC治疗的潜在靶点。

Background:Ulcerative colitis (UC) is a chronic inflammatory disorder.Studies have shown that intestinal injury of UC is related to changes of tight junction proteins.AimsTo investigate the expressions and localizations of tight junction protein claudin-1,-2,-4.MethodsForty female Wistar rats were randomly divided into normal control group and model group.Rats in model group

7.5 mg/mL oxazolone enema to induce experimental colitis.Rats received 0.9% NaCl solution enema were served as normal controls.Macroscopic score and histological score were assessed.ELISA was used to determine serum and colon tissue inflammatory factor TNF-α,IL-4,IL-5,IL-10 levels.Protein expressions of tight junction protein claudin-1,-2,-4 were measured by immunohistochemistry and Western blotting.mRNA expressions of claudin-1,-2,-4 were determined by real-time PCR.ResultsCompared with normal control group,macroscopic score and histological score were significantly increased (P<0.05),serum and colon tissue IL-4 and IL-5 levels were significantly increased (P<0.05) in model group,however,no significant differences in TNF-α and IL-10 levels were found between the two groups (P>0.05).mRNA and protein expressions of claudin-1,-4 were significantly decreased in model group than in normal control group (P<0.05),while mRNA and protein expressions of claudin-2 were significantly increased (P<0.05).ConclusionsChanges of distributions and expressions of tight junction protein claudin-1,-2,-4 are found in experimental colitis rats,which may lead to impaired epithelial barrier,and might be served as potential target for treatment of UC.