苏惠春 孙婧 罗阳 韩悦 刘笑纯 张警兮 温禾 姚煦 王宝玺

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院过敏与风湿免疫科［苏惠春（现在福建医科大学附属第一医院皮肤科，350004福州）、孙婧（现在北京大学人民医院皮肤科）、罗阳、韩悦、刘笑纯、张警兮、温禾、姚煦］；中国医学科学院 北京协和医学院 整形外科医院皮肤科（王宝玺）

·论著·

特应性皮炎患者血清转谷氨酰胺酶2特异性IgE水平与病情相关性研究

苏惠春 孙婧 罗阳 韩悦 刘笑纯 张警兮 温禾 姚煦 王宝玺

210042南京，中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病医院过敏与风湿免疫科［苏惠春（现在福建医科大学附属第一医院皮肤科，350004福州）、孙婧（现在北京大学人民医院皮肤科）、罗阳、韩悦、刘笑纯、张警兮、温禾、姚煦］；中国医学科学院 北京协和医学院 整形外科医院皮肤科（王宝玺）

目的检测特应性皮炎（AD）患者血清中转谷氨酰胺酶2（TG2）特异性IgE（sIgE）的表达水平，并分析与患者病情的相关性。方法共入组77例AD患者，其中，44例≥12岁，33例＜12岁，内源性AD（特异性sIgE阴性，且总IgE＜150 kU/L）20例，外源性AD（一种以上的外源性过敏源sIgE++以上，或总IgE≥150 kU/L）49例。采用免疫捕获及生物素标记的酶联免疫分析法检测77例AD患者、40例成人寻常性银屑病患者和30例成人健康对照血清中TG2 sIgE水平。记录AD患者年龄、病程、SCORAD评分、嗜酸性粒细胞计数和总IgE及TG2的sIgE水平。结果≥12岁AD组、＜12岁AD组、银屑病组和对照组外周血TG2 sIgE水平（A450）分别为1.02±0.2、1.04±0.044、0.93±0.25、0.71±0.13。≥12岁AD、寻常性银屑病和健康对照组外周血中TG2 sIgE表达水平差异有统计学意义（χ2=37.407，P＜0.001）；两两组间比较发现，≥12岁AD组、银屑病组TG2 sIgE水平均显著高于对照组（t值分别为7.38、4.83，均P＜0.001）。内源性AD组TG2 sIgE水平（1.16±0.03）高于外源性AD组（1.02± 0.20）（t=2.27，P=0.02）。AD患者组TG2 sIgE水平与年龄、病程、SCORAD评分、嗜酸性粒细胞计数、血清总IgE水平均无显著相关性（r值分别为0.03、0.14、-0.04、-0.08和0.06，均P＞ 0.05）。结论AD患者血清中TG2 sIgE水平明显升高，TG2可能是AD患者的一种自身抗原，但TG2 sIgE与患者的病情严重程度无明显相关性。

皮炎，特应性；转谷酰胺酶；免疫球蛋白E；自身抗原；疾病严重程度指数

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）发病机制复杂，皮肤屏障功能缺陷［1］、皮肤微生物菌群失调［2］、Th1/Th2/Th22免疫失调以及自身变态反应均是重要发病机制［3］。自身变态反应是特应性疾病患者针对自身抗原产生特异性IgE（sIgE）抗体的一种异常免疫应答反应［4］。目前已经发现的自身变应原有至少140余种［5］。转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）是一种钙离子依赖性蛋白酶，参与形成表皮屏障等多种生物活动［6］。鉴于大多数AD患者存在皮肤屏障功能异常，我们推测除丝聚合蛋白外，作为皮肤屏障主要蛋白之一的TG2可能也参与AD发病。为此我们检测AD患者血清中TG2 sIgE，并分析与疾病严重度相关指标，探讨自身变态反应在AD发病中的作用。

对象与方法

一、研究对象

AD组77例，其中＜12岁33例，≥12岁44例，AD诊断采用Williams标准，所有患者就诊前1个月未接受系统糖皮质激素或其他免疫抑制剂治疗，2周内未服用抗组胺药物或外用强效糖皮质激素治疗；≥12岁AD组中，男17例，女27例，年龄12～58（25.42±12.48）岁；＜12岁AD组33例中，男15例，女18例 ，年龄1～11（5.63±3.02）岁。寻常性银屑病组中，男22例，女18例，年龄18～55（27.08±6.08）岁。30例健康对照组中，男8例，女22例，年龄20～55（28.57± 6.30）岁。≥ 12岁AD组、银屑病组和对照组间性别（χ2=5.878，P=0.053）、年龄（F=1.513，P=0.225）差异均无统计学意义。

根据血清总IgE和sIgE的水平将AD分为内源性AD（特异性sIgE阴性，且总IgE＜150 kU/L）和外源性AD（一种以上的外源性过敏源sIgE++以上，或总IgE ≥ 150 kU/L）［7］，其中内源性AD 20例，女13例，男7例，年龄（19.1±17.71）岁；外源性AD 49例，女25例，男24例，年龄（14.86±12.21）岁。两组之间性别（χ2=1.12，P=0.29）、年龄（t=0.47，P=0.64）差异均无统计学意义。

记录AD患者病程、SCORAD评分（包括主客观评分），测定血清中TG2 sIgE水平，其中66例计数外周血嗜酸性粒细胞，65例检测血清中总IgE（≥150 kU/L为异常），50例检测户尘螨sIgE（ImmunoCAP 250检测系统，美国赛默飞公司）。检测银屑病患者血清中TG2 sIgE水平。本研究已通过中国医学科学院皮肤病医院伦理委员会批准（2015快审第KY009号），研究对象均签署知情同意书。

二、材料和方法

1.材料：组织中TG2溶液（美国Fitzgerald公司，浓度1 g/L，相对分子质量72 000），生物素EZ⁃Link Sulfo⁃NHS⁃Bitotin（美国Thermo Scientific公司），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），包被有抗人IgE抗体的微孔板（德国福克公司）。

2.采用免疫捕获联合生物素标记的酶联免疫吸附法测定血清中TG2 sIgE水平：按说明书标记生物素，取6.5 μl 10 mmol/L生物素加入到1 ml TG2中混匀，冰上放置2 h，用BCA蛋白定量试剂盒测定生物素标记的TG2蛋白浓度。向包被抗IgE抗体的微孔板中加入受试者血清50 μl，同时设阴性、阳性质控及标准品测试孔。每份血清测3个复孔，20～25℃孵育1 h；300 μl清洗液洗涤3次后加入生物素标记4 mg/L的TG2溶液100 μl，阴性及阳性质控孔中加入100 μl尘螨D1液体，封板，室温孵育1 h；洗涤3次后加入100 μl链霉素亲和素标记的辣根过氧化物酶结合液，室温孵育30 min；洗涤3次后每孔加入 100 μl底物 3，3′，5，5′⁃四甲基联苯胺（TMB），37℃避光孵育20 min；最后加入100 μl 2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪450 nm处读取吸光度（A值）。

3.统计方法：采用GraphPad PRISM软件作图及SPSS17.0软件统计分析，组间性别比较采用卡方检验，sIgE水平比较采用多组间非参数Kruskal⁃Wallis检验，并使用Nemenyi进行两两比较；内外源性AD组间年龄、sIgE水平比较采用非配对t检验；各指标间的相关性分析采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、外周血TG2 sIgE表达水平比较

≥12岁AD组、＜12岁AD组、银屑病组和对照组外周血TG2 sIgE水平（A450）分别为1.02±0.20、1.04±0.044、0.93±0.25和0.71±0.13。非参数Kruskal⁃Wallis检验发现，≥ 12岁AD组、银屑病组和对照组外周血TG2 sIgE水平差异有统计学意义（χ2=37.407，P＜ 0.001），Nemenyi两两比较发现 ≥12岁AD组、银屑病组TG2 sIgE水平显著高于对照组（t值分别为7.38、4.83，均P＜ 0.001），且 ≥ 12岁AD组高于银屑病组（t=2.66，P=0.008）。

图1 特应性皮炎（AD）患者外周血血清中转谷氨酰胺酶2（TG2）sIgE水平与年龄（1A）、病程（1B）、SCORAD 评分（1C）、外周血嗜酸性粒细胞计数（1D）、总IgE（1E）的相关性分析 TG2 sIgE水平与上述指标均无相关性

内源性AD组TG2 sIgE表达水平为1.16±0.30，外源性AD组为1.02±0.20，两组差异有统计学意义（t=2.372，P=0.02）。

二、AD患者TG2 sIgE水平与病情相关性分析

77例AD患者SCORAD评分39.73±16.11，外周血嗜酸性粒细胞计数（0.34±0.30）×109个/L，总IgE（618.14±1 100.67）kU/L。Spearman相关性分析发现，AD患者外周血TG2 sIgE水平与年龄、病程、SCORAD评分、外周血嗜酸性粒细胞计数（65例）、总IgE水平（66例）均无显著相关性（r值分别为0.03、0.14、-0.04、-0.08和 0.06，P值分别为 0.78、0.24、0.74、0.54和0.62）。见图1。

讨 论

自身变态反应是近几年逐渐被关注的AD新发病机制之一，AD的自身变态反应机制研究证据包括：①AD患者血清存在针对某些自身抗原的sIgE抗体，而健康对照组则检测不出［8⁃9］；②某些抗自身抗原的sIgE如抗磷脂抗体（ACL）、抗β2糖蛋白、rhMnSOD的sIgE表达水平与AD患者SCORAD评分呈正相关，具有自身抗原sIgE抗体的AD患者病情往往比未检测到这些抗体的患者更为严重，而且AD患者病情发作时常可检测到自身抗原sIgE升高［10］。

AD患者的自身过敏原大致可分为3类：①与外源性过敏原有交叉过敏的自身过敏原，如与桦树抗原交叉过敏的肌动蛋白；②与外源过敏原无关的自身过敏原，如Hom1⁃Hom5；③“经典”的自身抗原：如Dsg1、BP180、核抗原等，这些抗原不仅可以诱发机体产生特异性IgG，还可诱导机体产生sIgE，并且与疾病活动度相关［4］。有研究采用噬菌体表面展示技术构建cDNA文库，筛选出至少140种可与IgE结合的自身抗原与特应性湿疹相关，TG2属于其中的一种［5］。Currò等［11］用实时定量 RT⁃PCR 方法检测发现，慢性牙周炎患者病变组织TG2基因的表达水平高于健康人。我们发现，AD患者TG2 sIgE水平明显高于对照组，内源性AD患者TG2 sIgE水平高于外源性AD患者，并且其水平与总IgE及尘螨sIgE水平无关，推测TG2是一种与尘螨抗原无关的自身抗原。银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，有研究发现银屑病患者针对某些抗原的sIgE水平升高，但低于AD患者TG IgE水平［12］。我们发现寻常性银屑病患者TG2 sIgE水平高于健康人，表明银屑病患者体内可能存在针对TG2的自身变态反应。

自身抗原释放机制包括以下几个方面［13⁃14］：①外源性过敏原诱发皮肤炎症反应和引起表皮免疫损伤，如尘螨抗原中含有破坏皮肤屏障的蛋白酶；②瘙痒所致的搔抓引发皮肤机械性损伤，进而导致细胞内蛋白释放；③皮损处局部微生物定植异常，导致慢性炎症和组织损伤致使自身抗原释放。自身抗原暴露后，刺激机体产生针对自身抗原的变态反应。以往的研究提示，机体针对自身抗原的过敏反应是AD炎症顽固迁延的一个重要原因，外源性过敏原通过诱导Th2型免疫反应引起急性炎症，而自身过敏原更趋向于诱导Th1型反应，引起肿瘤坏死因子α、白细胞介素12表达升高，导致慢性炎症反应［15⁃16］。TG2主要分布在表皮基底层，推测AD患者表皮屏障破坏导致基底层TG2进入真皮，引起下游免疫反应及IgE抗体释放，从而参与疾病发生和发展。我们未发现AD患者TG2 sIgE抗体水平与嗜酸性粒细胞计数、SCORAD评分、总IgE等病情严重度指标相关，这可能是因为入组的样本量偏小，或者TG2升高与别的因素相关，后期将进一步扩大样本量。对于TG2 sIgE阳性患者，我们拟进行随访，观察同一患者病情变化与血清TG2 sIgE水平的关系，寻找其可能的发病机制。

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Relationship between the serum level of transglutaminase 2⁃specific IgE and disease condition in patients with atopic dermatitis

Su Huichun,Sun Jing,Luo Yang,Han Yue,Liu Xiaochun,Zhang Jingxi,Wen He,Yao Xu,Wang Baoxi
Department of Allergy and Rheumatology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Su HC［current affiliation:Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China］,Sun J［current affiliation:Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital］,Luo Y,Han Y,Liu XC,Zhang JX,Wen H,Yao X）;Department of Dermatology,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144,China（Wang BX）

s:Yao Xu,Email:dryao xu@126.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

ObjectiveTo detect the serum level of transglutaminase 2（TG2）⁃specific IgE（sIgE）in patients with atopic dermatitis（AD）,and to analyze its correlation with the disease condition.MethodsA total of 77 patients with AD were enrolled into this study,including 44 patients aged≥12 years and 33 patients aged＜12 years.Of the 77 patients,20 were diagnosed with intrinsic AD,which was characterized by the absence of sIgE and total serum IgE values＜150 kU/L,and 49 with extrinsic AD characterized by positive（++）or even strongly positive sIgE for more than 1 kind of exogenous allergens,or total serum IgE values≥ 150 kU/L.Immunocapture⁃biotinylated detector enzyme immunoassay was performed to detect the serum level of TG2⁃sIgE in 77 patients with AD,40 adult patients with psoriasis vulgaris（PV）and 30healthy adult controls.Clinical data on the AD patients were recorded,including age,disease duration,SCORAD score,blood eosinophil count,levels of total IgE and TG2⁃sIgE.Results The serum levels of TG2⁃sIgE in AD patients aged≥12 years,AD patients aged＜12 years,PV patients and healthy controls were 1.02±0.2,1.04±0.044,0.93±0.25 and 0.71±0.13,respectively.Additionally,the serum level of TG2⁃sIgE significantly differed among AD patients aged ≥ 12 years,PV patients and healthy controls（χ2=37.407,P＜0.001）,and was significantly higher in both AD patients aged≥ 12 years and PV patients than in the healthy controls（t=7.38,4.83,respectively,bothP＜ 0.001）.Moreover,the intrinsic AD group showed significantly higher TG2⁃sIgE levels compared with the extrinsic AD group（1.16 ± 0.03vs.1.02 ±0.20,t=2.27,P=0.02）.The TG2⁃sIgE level was uncorrelated with the patients′age,disease duration,SCORAD score,blood eosinophil count or serum total IgE levels in AD patients（r=0.03,0.14,-0.04,-0.08,0.06,respectively,allP＞ 0.05）.ConclusionThe serum level of TG2⁃sIgE obviously increases in AD patients,so TG2 may be one kind of autoantigen in AD patients,but there is no significant correlation between the TG2⁃sIgE level and AD severity.

Dermatitis,atopic；Transglutaminases；Immunoglobulin E；Autoantigens;Severity of illness index

姚煦，Email：dryao_xu@126.com；王宝玺，Email：wangbx@ncstdlc.org

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.07.009

国家自然科学基金（81371735、81573045）；2014年亚美医学基金会（MMAAP）皮肤病项目基金；江苏省自然科学基金（BK20150166）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81371735,81573045）;Milstein Medical Asian American Partnership（MMAAP）Foundation Research Project Award in Skin Disease in 2014;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20150166）

2016⁃10⁃09）

（本文编辑：尚淑贤）