王贵金，宋剑，毕丹，贾继明

(河北以岭医药研究院有限公司，河北 石家庄 050035)

·中药工业·

淫羊藿提取物中总黄酮含量测定方法的改进△

王贵金，宋剑，毕丹，贾继明*

(河北以岭医药研究院有限公司，河北 石家庄 050035)

目的：对《中国人民共和国药典》方法和改进法在测定淫羊藿提取物中总黄酮含量的研究分析。方法：以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4个不同的对照品为对照按照《中国人民共和国药典》方法测定混合对照品的含量，与改进法通过折合分子量计算校正因子，再通过校正因子计算淫羊藿提取物中总黄酮的含量，将结果进行比较。结果：《中华人民共和国药典》中测定淫羊藿中总黄酮含量的方法误差较大，而改进法以朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷为对照品测定淫羊藿提取物的含量，乘以相应的校正因子，得到的含量结果接近真实值。结论：改进方法简便易行，专属性强，是理想的测定淫羊藿提取物中总黄酮含量的方法。

淫羊藿苷；总黄酮；淫羊藿提取物

肌萎灵冻干粉用于治疗运动神经元疾病、进行性肌营养不良症、硬皮病、多发性硬化、多发性神经炎、多发性肌炎、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎缩，也可用于重症肌无力的治疗[1]。本制剂由人参提取物和淫羊藿提取物两味中药组成，《中华人民共和国药典》仅收载了人参提取物的总皂苷的含量测定方法[2]，而淫羊藿提取物中总黄酮的含量测定方法的研究未见报道，直接使用《中华人民共和国药典》中对淫羊藿药材中总黄酮含量测定方法测定[2]，误差较大，鉴于黄酮类成分有较好的生物活性[3-8]，为了更好地控制肌萎灵冻干粉的质量，保证临床用药的安全有效，作者对淫羊藿提取物中总黄酮的含量测定方法进行研究，与《中华人民共和国药典》中淫羊藿药材的总黄酮的含量测定方法进行比较，并对药典方法进行改进，通过折合分子量计算出校正因子，应用于淫羊藿提取物的总黄酮的含量测定方法中，增加了方法的准确性和专属性。

1 仪器与试药

Cary60紫外-可见分光光度计(美国安捷伦公司)；XP105DR型十万分之一电子天平(Mettlet Toledo)；Millipore A10型超纯水机(美国密理博公司)；KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

朝藿定A、朝藿定B(成都曼斯特生物制品有限公司，纯度大于98%)；朝藿定C(中国食品药品检定研究院，批号：111780-200801，纯度99.1%)；淫羊藿苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111607-200402，供含量测定用)；淫羊藿提取物(石家庄以岭药业股份有限公司，批号分别为20141003，20141101，20150101)；乙醇(北京化学试剂厂，分析纯)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取朝藿定A对照品11.62 mg、朝藿定B对照品10.12 mg、朝藿定C对照品11.30 mg、淫羊藿苷对照品10.16 mg，置不同的100 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液，分别精密吸取储备液1 mL置不同10 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 混合对照品的制备 精密称取朝藿定A对照品6.32 mg、朝藿定B对照品5.68 mg、朝藿定C对照品10.46 mg、淫羊藿苷对照品19.62 mg，置同一100 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液，精密吸取储备液1 mL置50 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别精密称取20141003批淫羊藿提取物33.21 mg、20141101批淫羊藿提取物34.56 mg、20150101批淫羊藿提取物35.34 mg，置不同的50 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液，分别精密吸取储备液1 mL置不同50 mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 最大波长的选择

取2.1项下对照品、混合对照品、供试品(批号20141003)分别在200～800 nm波长范围内扫描，发现对照品和供试品均在270 nm左右最大吸收，吸收峰相似，故选择270 nm作为淫羊藿提取物总黄酮含量测定的波长，见图1。

图1 最大波长扫描图谱

2.3 线性关系考察

分别取2.1.1项下的对照品储备液，分别精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至不同的10 mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀。以稀乙醇为空白，照紫外分光光度法在270 nm处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制4个对照品的标准曲线，朝藿定A的标准曲线为Y=0.027X+0.001 7，r=0.999 9(n=5)，表明朝藿定A对照品溶液在5.81～29.05 μg·mL-1线性良好；朝藿定B的标准曲线为Y=0.030 6X+0.000 7，r=0.999 8(n=5)，表明朝藿定B对照品溶液在5.06～25.30 μg·mL-1线性良好；朝藿定C的标准曲线为Y=0.03X-0.002 2，r=0.999 9(n=5)，表明朝藿定C对照品溶液在5.65～28.25 μg·mL-1线性良好；淫羊藿苷的标准曲线为Y=0.035 8X-0.000 1，r=0.999 8(n=5)，表明淫羊藿苷对照品溶液在5.08～25.40 μg·mL-1线性良好。

2.4 精密度试验

分别取2.1.1项下的对照品溶液，以稀乙醇为空白，照紫外分光光度法在270 nm处测定吸光度(n=5)，结果朝藿定A的RSD为0.25%，朝藿定B的RSD为0.17%，朝藿定C的RSD为0.21%，淫羊藿苷RSD为0.26%，精密度结果良好。

2.5 稳定性试验

分别取2.1.1项下的对照品溶液，以稀乙醇为空白，照紫外分光光度法在270 nm处分别于0、2、4、8、12、24 h测定吸光度(n=6)，结果朝藿定A的RSD为0.35%，朝藿定BRSD为0.28%，朝藿定C的RSD为0.31%，淫羊藿苷RSD为0.37%，对照品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 《中华人民共和国药典》法对混合对照品的含量测定

分别取2.1.1项对照品溶液和2.1.2项下的混合对照品的溶液，以稀乙醇为空白，照《中华人民共和国药典》2015版，淫羊藿总黄酮含量测定项下的紫外分光光度法在270 nm处测定吸光度并计算含量，结果见表1。

表1 《中华人民共和国药典》法对混合对照品含量测定结果

2.7 含量计算方法的改进

根据混合对照品中每个对照品取样所占的不同百分比，结合对照品的不同分子量，与百分比进行相乘，计算的折合分子量相加即为混合对照品的折合分子量，再用混合对照品的折合分子量与对照品分子量作比值，此比值作为含量计算时需要折合的校正因子，即可计算出相对准确的结果，将表1的含量结果以校正因子进行优化，结果见表2

表2 混合对照品含量测定结果的改进

2.8 《中华人民共和国药典》法与改进法对3批样品的含量测定

取2.1项下的淫羊藿苷对照品和供试品溶液以稀乙醇为空白，照紫外分光光度法在270 nm处测定吸光度(药典法)并根据校正因子(改进法，校正因子见表2中)计算含量，结果见表3。

表3 《中华人民共和国药典》法与改进法对3批样品含量测定结果

3 结果与讨论

从表1结果可以看出，按照《中华人民共和国药典》2015版淫羊藿总黄酮含量测定方法，以淫羊藿苷为对照品计算混合对照品的含量，仅为91.03%，混合对照品的实际含量应该接近100%，而以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C为对照品，按照药典方法测定混合对照品的含量，均大于100%。而表2的改进法中分别以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷为对照品测定的含量，结果分别乘以相应的校正因子，得到混合对照品的含量，除了以朝藿定A为对照的结果外，其他3个对照品计算的含量值都接近100%，与实际结果相符合。因此测定淫羊藿提取物的总黄酮含量，使用药典中淫羊藿苷为对照品时，含量结果应该用改进法乘以校正因子1.12，结果才更加接近真实值。

淫羊藿提取物作为注射用肌萎灵冻干粉的制剂投料中间体，其总黄酮的含量测定准确性对制剂的质量标准有着至关重要的作用。

《中华人民共和国药典》中测定淫羊藿总黄酮的方法主要是针对淫羊藿药材而制定，在朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量不高的情况下，误差较小，但是当淫羊藿提取物得到纯化后，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C含量对总黄酮含量影响很大，按照药典方法以淫羊藿苷为对照品计算误差很大，因为从表2改进法结果可以看出，淫羊藿苷在4个主要成分中分子量最小，比折合分子量值还小，所以药典方法测定淫羊藿总黄酮的值偏低，必须乘以校正因子进行校正。

用4个对照品进行校正因子折合计算中，除了朝藿定A以外，其余结果均与实际值相符，说明此方法可行，朝藿定A之所以有误差一是它的分子量最大，比折合分子量大很多；二是它在总量中含量很小，二者结合导致计算误差偏大，建议在计算淫羊藿提取物中总黄酮含量时，可以选择朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷为对照品并乘以校正因子。

[1] 吴以岭.一种治疗肌肉萎缩及重症肌无力的药物及其制备方法：200410096779.8 [P].2007-12-12.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015.

[3] 孟宪丽，曾南，张艺，等.淫羊藿有效成分对老龄雄性大鼠下丘脑单胺类神经递质及其他脑功能作用的研究[J].中国中药杂志，1996，21(11)：683-685.

[4] 王东芝，李东万，张守刚.淫羊藿在心血管疾病方面的研究进展[J].浙江中医药大学学报，2013，37(1)：107-110.

[5] 赵文昌，宋丽军，温凯航，等.淫羊藿抗骨质疏松症的研究进展[J].中国医药导报，2012，9(25)：20-23.

[6] 钱力，翁文杰，李成荫，等.淫羊藿黄酮类化合物对骨及软骨细胞作用研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2012，18(3)：347-349.

[7] 蔡曼玲，季晖，刘悦，等.五种淫羊藿黄酮类成分对体外培养成骨细胞的影响[J].中国药理通讯，2004，21(3)：13-14.

[8] Meng F H，L i Y B，Xiong Z L，et al.Ost eoblast ic proliferative ac tivity of Epimedium brevicornum Maxim[J].Phytomedicine，2005，12(3)：189-193.

ImprovementofDeterminationMethodofTotalFlavonoidsinEpimediumExtract

WANGGuijin，SONGJian，BIDan，JIAJiming*

(HebeiYilingMedicalResearchAcademyCo.Ltd.，Shijiazhuang050035，China)

Objective：To improve the pharmacopoeia method for determination of total flavonoids inEpimediumextract.Methods：Epimedin A，epimedin B，epimedin C and icariin were used as reference substance to determine the total flavonoids with the pharmacopoeia method as the contrast.Results：The improved method had a better accuracy of measurement comparing to pharmacopoeia method.Conclusion：The improved method is easy，accurate，specific，and better suitable for determine the content of total flavonoids inEpimediumextract

Icariin；total flavonoids；Epimediumextract

国家重点基础研究发展计划(973)项目(2012CB518600)

] 贾继明，正高级工程师，研究方向：天然产物研究；E-mail：jiajiming@yiling.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.021

2016-05-10)

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