聂西周，何娟，龙凯花，王春柳，李晔，张瑞瑞，刘峰，*

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075；3.西安培华学院，陕西 西安 710100；4.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003；5.陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

·中药工业·

HPLC测定头痛宁胶囊中二苯乙烯苷含量△

聂西周1，何娟2，龙凯花3，王春柳4，李晔4，张瑞瑞5，刘峰2，5*

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046； 2.陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075；3.西安培华学院，陕西 西安 710100；4.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003；5.陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

目的：建立头痛宁胶囊中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷)的HPLC含量测定方法。方法：采用Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，以乙腈-水(16∶84)为流动相为，流速1.0 mL·min-1，检测波长320 nm，柱温35 ℃。结果：二苯乙烯苷在0.278 5 ～2.785 0 μg浓度范围内线性关系良好(r=0.999 8)，二苯乙烯苷的平均回收率为102.31%，RSD为1.21%；头痛宁胶囊中二苯乙烯苷含量为每粒0.89～1.77 mg。结论：该法易于操作、准确度高、重现性好，可以作为头痛宁胶囊中二苯乙烯苷的质量控制方法。

头痛宁胶囊；高效液相色谱法；二苯乙烯苷；含量测定

头痛宁胶囊由土茯苓、天麻、制何首乌、防风、当归及全蝎六味中药组成的中成药，具有熄风涤痰、逐瘀止痛之功效，临床主要用于偏头痛、紧张性头痛属痰瘀阻络证[1]，临床疗效显著[2-4]，已收载于《国家基本医疗保险、工伤保险和生育药品目录》(2009年版)，临床使用广泛，已进入中药大品种行列。鉴于何首乌中的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(二苯乙烯苷)具有抗内皮细胞损伤、抗动脉粥样硬化、降血脂、抗脑缺血、舒张血管等多方面的药理作用[5-7]，与头痛宁胶囊的缓解脑血管痉挛、增加大脑供血供氧、改善大脑微循环等作用[8]相关，是制何首乌的主要药效成分之一。基于二苯乙烯苷既是方中的药效成分，本研究建立头痛宁胶囊中二苯乙烯苷的含量测定方法，进一步提高头痛宁胶囊质量标准，为头痛宁胶囊的生产全过程质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国安捷伦1260系列高效液相色谱仪，四元梯度泵，二极管阵列检测器(DAD)，自动进样器，OpenLAB CDS ChemStation工作站。U-2910紫外可见分光光度计，Sartorius BP211D分析天平，Sartorius BP61分析天平，KH-300DE超声清洗器等。

1.2 试药

2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110844-201310，供含量测定用，纯度：91%)。头痛宁胶囊(陕西步长制药有限公司，批号：141226、150120、150121、150122、150123、150130、150131、150132、150133、150134，规格：0.4 g/粒)，水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher)。其它试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(16∶84)，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：320 nm，柱温35 ℃。理论塔板数以2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷1.114 mg的溶液。

2.2.2 供试品溶液 取头痛宁胶囊装量差异项下的内容物约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min(功率250 W，频率40 kHz)，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按头痛宁胶囊的处方比例和制备方法，制成不含制何首乌药材的阴性对照样品，按2.2.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。结果表明，在与对照品色谱相应位置上，供试品溶液与其它组分分离度良好，阴性对照样品无干扰，见图 1。

注：1～2.供试品；3～4.阴性对照样品；5～6.对照品。图1 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品、供试品、阴性对照样品重叠HPLC图

2.4 线性关系考察

精密吸取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液(1.114 mg·mL-1)，用70%乙醇稀释，浓度分别为55.7、69.625、92.833、139.25、278.5、557 μg·mL-1，在上述条件下测定峰面积，以2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷浓度(X)与峰面积(Y)作标准曲线，计算回归方程为Y=10.478 2X-82.389 0(r=0.999 8)。结果表明二苯乙烯苷在0.278 5～2.785 0 μg浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液5 μL，连续重复进样6次，测定，记录其峰面积值，分别是888.5、890.8、882.3、883.2、888.3、888.3，结果RSD为0.38%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一批号供试品溶液(批号：150134)，分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定，计算其RSD为0.51%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批号供试品(批号：150134)2.5 g，平行6份，按供试品溶液同法制备，精密吸取5 μL，注入液相色谱仪，测定，平均含量为2.88 mg·g-1，RSD为1.93%，表明本法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量重复性试验项下的样品约0.5 g(批号：150134；含量:2.878 mg·g-1)，平行6份，分别精密加入2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液，按供试品溶液同法制备，测定含量，结果表明，平均回收率为102.31%，RSD为1.21%，结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.9 供试品含量测定

分别取10个批次的头痛宁胶囊，按照2.2.2项下，制备供试品溶液，以2.1项下色谱条件，进行测定。结果显示，头痛宁胶囊中二苯乙烯苷含量限度范围为0.89～1.77 mg/粒，平均值为1.26 mg，结果见表2。

表2 10批样品测定结果(n=2)

3 讨论

参考《中华人民共和国药典》[9]，对头痛宁胶囊中制何首乌的二苯乙烯苷含量测定方法进行了考察。以稀乙醇为溶剂，分别考察了加热回流和超声处的提取效果，结果表明两种方法含量测定结果差异无统计学意义，故选择快捷方便的超声提取方法；在溶剂选择的考察中，分别用甲醇、70%乙醇和药典所用的稀乙醇作为提取溶媒，采用超声提取，其平均峰面积与样品量的比值为70%乙醇大于甲醇、稀乙醇，故确定70%乙醇为提取溶剂；超声时间的选择，分别超声处理(功率250 W，频率40 kHz)20、30、40 min，发现超声30 min和40 min含量测定结果接近，故确定超声时间为30 min。本研究还采用Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)不同色谱柱，进行耐受性的考察，结果样品欲测定峰均能基线分离。

10个批次的头痛宁胶囊中二苯乙烯苷含量为每粒0.89～1.77 mg，批间差异较大，并对差异最大的150120和150133两批次进行了室温干燥放置16个月的稳定性的考察，实验结果显示，批号为150120的头痛宁胶囊中二苯乙烯苷含量由原来的1.77 mg/粒下降至1.10 mg/粒，批号为150133由0.89 mg/粒下降到0.54 mg/粒，究其原因，主要是由于二苯乙烯苷具有光、热、酸、碱不稳定性[10-11]，且制何首乌饮片在炮制生产过程对二苯乙烯苷含量影响非常显著[12]，饮片的批间差异也很大。提示在药品生产全程质量控制中，既要加强各生产单元的过程控制，更应控制投料饮片的质量均一稳定，减小药品的批间差异，逐步实现质量均一、稳定、安全、可控。同时，针对头痛宁胶囊中二苯乙烯苷，储运应在避光、阴凉环境下进行。

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DeterminationofStilbeneGlycosideinToutongningCapsulesbyHPL

CNIEXizhou1，HEJuan2，LONGKaihua3，WANGChunliu4，LIYe4，ZHANGRuirui5，LIUFeng2，5*

(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China；2.ShaanxiBuchangPharmaceuticalLimitedCompany，Xi’an710075，China； 3.Xi′anPeihuaUniversity，Xi’an710100，China； 4.ShaanxiAcademyofTraditionalChineseMedicine，Xi’an710003，China； 5.ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce，Xianyang712046，China)

Objective：To establish a HPLC method for the determination of 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(Stilbene glycoside)in Toutongning capsules.Methods：HPLC was applied to the quantitative analysis using a Kromasil C18column(250 mm×4.6 mm，5μm).The flowing phase was acetonitrile-water(16∶84)and detecting wavelength was 320 nm.The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 35 ℃.Results：The calibration curve had good linear relationship in the range of 0.278 5 ～2.7850 μg(r=0.999 8).The average recovery was 102.31% and RSD was 1.21%.The content of stilbene glucoside in Toutongning capsules was 0.89 ～ 1.77 mg per cap.Conclusion：The method is easy to operate，accurate，reproducible and can be used for the determination of stilbene glycoside in Toutongning capsules.

Toutongning capsules；HPLC；stilbene glycoside；content determination

陕西省社会发展科技攻关项目(2016SF-368)；2015年陕西省创新人才推进计划-重点科技创新团队计划(步长制药中药大品种技术改造和二次开发创新团队，2015KCT-19)

] 刘峰，主任药师，研究方向：中药新药研发和大品种技术改造及开发研究；Tel：(029)88318318，E-mail：liufeng1720@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.022

2016-06-21)

*[