白丽丽，周紫梦，戴华

(1.海南医学院 药学院，海南 海口 571199；2.海南医学院公共卫生学院，海南 海口 571199)

·中药工业·

番石榴果实中总黄酮的提取及含量测定△

白丽丽1，周紫梦1，戴华2*

(1.海南医学院 药学院，海南 海口 571199；2.海南医学院公共卫生学院，海南 海口 571199)

目的：采用正交试验法优选番石榴果实中总黄酮的提取工艺。方法：以提取的总黄酮含量为评价指标，选择醇的体积分数、料液比、提取时间和提取次数为考察因素，用正交试验法确定黄酮的最佳提取工艺。通过分光光度法测定总黄酮的含量，检测波长为508 nm。结果：最佳工艺为醇的体积分数60%，料液比1∶25，提取时间2.5 h，提取3次。芦丁在8.24～50.42 mg·L-1具有良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为98.23%(RSD=1.36%)。总黄酮含量可达到1.54%。结论：确定的提取工艺简单、易于操作，提取率高。建立的定量方法可用于番石榴总黄酮的测定。

番石榴；总黄酮；提取；正交试验法

番石榴Psidium guajava L.，Guava.属于桃金娘科番石榴属，常绿多年生的灌木植物，在我国海南、广东、广西、福建等地区有栽种。番石榴叶子、果实均有药用价值，我国传统医药用来治疗轻、中度糖尿病，已经引起越来越多学者的关注[1-4]。番石榴叶中含有多种化学成分，具有抗糖尿病活性的主要有黄酮类、多酚和鞣质类、萜类、甾体类等化学成分。黄酮类化合物广泛存在于自然界，主要以黄酮苷的形式存在，具有毒性低、来源广泛等优点。已经从番石榴叶中分离出的黄酮类化合物包括芦丁、槲皮素、杨梅素、番石榴苷、槲皮素糖苷、无色花青素等。现代药理学研究表明，番石榴提取物中降血糖有效成分可能是黄酮苷类及多糖类化合物，因此，对番石榴中黄酮的研究作为开发抗糖尿病的新药将具有广泛的前景和意义[5-8]。目前，对番石榴中黄酮的研究主要集中在叶子上，但对番石榴果实中黄酮的研究鲜有报道[9-11]。本研究探讨番石榴果实中黄酮提取的影响因素，通过正交试验筛选最优提取工艺，为研究开发番石榴中的化学成分提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV1600型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)；B210S分析天平(北京赛多利斯有限公司)；R系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)；KQ-200KDE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 试药

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号100080-201408)；其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

番石榴果实采自海南文昌，经海南医学院药学院杨卫丽副教授鉴定为桃金娘科番石榴属番石榴。将其清洗，70 ℃烘干至恒重，粉碎过40目筛后备用。

2 方法及结果

2.1 方法学考察

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在105 ℃条件下干燥至恒重的芦丁对照品10.5 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇适量，超声5 min至溶解，定容，得质量浓度为0.21 mg·mL-1的芦丁对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取番石榴粉末2.0 g共5份，分别置于圆底烧瓶中，用60%乙醇溶液加热回流2 h，过滤后于50 mL容量瓶中用60%乙醇溶液定容，摇匀，得供试品溶液。

2.1.3 检测波长的选择 精密量取芦丁对照品溶液、供试品溶液以及空白溶液各4.0 mL于25 mL容量瓶中，精密加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液8 mL，然后加入60%乙醇溶液定容，摇匀，放置15 min，照分光光度法于200～600 nm进行扫描，芦丁与供试品溶液的最大吸收波长在508 nm处，故选用508 nm作为检测波长。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密量取芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，操作同2.1.3项下方法，照分光光度法在508 nm处测定其吸光度。以浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程为Y=0.011 9X+0.027 0，r=0.999 9，表明芦丁在8.24～50.42 mg·L-1线性关系良好。

2.1.5 稳定性考察 精密吸取供试品溶液4 mL，操作同2.1.3项下方法，在室温和室内光照条件下密闭放置，分别在0、15、30、60、90、120 min测定其吸光度，RSD为2.3%(n=6)，结果表明，供试品溶液在2 h之内较稳定，满足实验的要求。

2.1.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液4 mL，操作同2.1.3项下方法，连续5次测定其吸光度，RSD为0.11%(n=5)，结果表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验 称取6份番石榴果实药材粉末，每份约5 g，精密称定，按2.1.2项方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液，操作同2.1.3项下方法，分别测定其吸光度值，RSD为0.60%(n=6)，结果表明该分析方法重复性良好。

2.1.8 加标回收试验 精密吸取6份供试品溶液2 mL，分别加入芦丁对照品溶液2.6 mL，操作同2.1.3项下方法，在508 nm处测定吸光度。见表1。

表1 加标回收试验结果(n=6)

由表1可知，平均回收率98.23%，RSD为1.36%，结果表明回收率较好，符合实验要求。

2.2 总黄酮的提取工艺优选

2.2.1 因素及水平考察 以提取的总黄酮含量作为评价指标，通过单因素试验选择乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、回流时间(1、1.5、2、2.5 h)、提取次数(1次、2次、3次)等因素和水平进行试验。确定较好的提取因素与水平：醇体积分数为60%，料液比为1∶25，回流2 h，提取次数为3次。然后确定醇的体积分数为60%，选择提取次数、料液比、提取时间3个因素，每个因素3个水平，设定因素水平表，见表2。

表2 正交试验因素及水平表

2.2.2 正交试验结果及分析 称取番石榴粉末5.0 g，设计正交试验，加入60%乙醇溶液加热回流，过滤、浓缩，用60%乙醇定容至50 mL，采用分光光度法测定其含量，正交试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

注：F0.05(2，2)=19.0。

对表3进行直观分析可知，极差大小显示各因素的影响作用依次为A>B>C。表4表明，A因素对番石榴总黄酮的提取有显著影响意义，B、C两因素无显著影响意义。为此，结合表3又做了2组加水平试验，确定提取次数为3次，乙醇浓度为60%，见表5。结果再次验证B、C两因素为无显著影响效应。综合直观分析和方差分析的结果，确定番石榴果实中总黄酮的最优提取工艺为A3B3C3，即乙醇体积浓度为60%，提取3次，料液比1∶25，回流2.5 h。

表5 加水平试验结果

2.2.3 工艺验证性试验 为考察上述优选提取工艺的稳定性，按上述最优工艺条件A3B3C3进行了3次重复性试验，番石榴果实中总黄酮的含量分别为1.54%、1.55%、1.54%，平均含量达到1.54%，表明本正交试验设计的工艺路线稳定，具有良好的可重复性。

3 讨论

3.1 料液比和时间的确定

通过加标试验，当料液比增加至30倍量时，总黄酮的提取含量反而稍有下降；当提取时间延长至3 h后，总黄酮的含量未见明显增加。因此，从经济和效率等方面考虑，确定最佳料液比为1∶25，提取时间为2.5 h。

3.2 提取次数的确定

通过正交试验直观分析发现，A因素即提取次数对总黄酮的提取影响最为显著。当其他水平相同的条件下，提取次数增至为3次时总黄酮的含量有明显增加，因此确定最佳提取次数为3次。

番石榴叶中总黄酮含量因提取方法不同含量有所不同，如彭珊珊等[3]采用乙醇浸提与超声法相结合得总黄酮1.27%；林燕如等[10]采用微波结合回流法得到总黄酮浓度高达9.91%。产地不同含量亦有所不同[11]。本研究通过正交试验法对番石榴果实中总黄酮的提取条件进行优化，确定了最佳提取工艺，总黄酮收率达到1.54%。结果表明，该方法工艺简单、易于操作、提取率高，为番石榴果实中黄酮类活性成分的进一步研究与开发提供参考。

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StudyonExtractionProcessandDeterminationofTotalFlavonoidsinFruitsofPsidiumguajava

BAILili1，ZHOUZimeng1，DAIHua2

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China； 2.SchoolofPublicHealth，HainanMedicalUniversity，Haikou571199，China)

Objective：To study the optimum extraction process of total flavonoids in fruits ofPsidiumguajava.Methods：An orthogonal experiment was designed to obtain the best extraction conditions，in which 4 factors (alcohol concentration，fruits：ethanol ratio，reflux time and extraction times)were examined，with the extraction rate of total flavonoids as the final indicator.The content of total flavonoids was determined by spectrophotometry at 508 nm.Results：The optimum extraction technology was identified as follows：extraction solvent，60 percent ethanol；fruits：ethanol ratio，1∶25；reflux time，2.5 h；extraction times，3 times.The linear ranges of the total flavonoids was 8.24-50.42 mg·mL-1(r=0.999 9).The average recovery was 98.23%(RSD=1.36%).The total flavonoids were 1.54%.Conclusion：The process proved to be simple and reasonable，with high extraction rate and feasibility.The determination method was easy and accurate which can be used for the study of total flavonoids inP.guajava.

Psidiumguajava；total flavonoids；extraction；orthogonal test

海南省自然科学基金(214033)

] 戴华，讲师，研究方向：食品卫生学研究，E-mail：daiborn@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.021

2016-04-30)

*[