曾文滔，周建丽，赵书琴，张亚男，梅 云

研究报告

C57BL/6J 小鼠冻融IVF原核胚用于Cas9 显微注射探讨

曾文滔*，周建丽，赵书琴，张亚男，梅 云

体外受精(Invitrofertilization，IVF)与胚胎冷冻技术已广泛应用于不孕不育医学、种质资源保存、物种运输等行业[1-3]，大量文献证明冷冻胚胎的发育时期、保存时间长短对复苏存活率、附植及产仔率没有明显的影响[4,5]，冻融自然受精原核胚很早就被用于转基因鼠制作[6-8]，IVF受精胚冻融后用于显微注射还鲜有报道，对小鼠基因模型构建将有重要的实用意义。

C57BL/6(B6)小鼠一直是基因模型鼠制作的主要品系，超数排卵后自然交配获得原核胚或早期胚胎进行基因改造[9]。随着B6小鼠体外受精技术的完善，采用冻精(鲜精)IVF技术批量生产胚胎可节约大量科研经费和时间，大型基因编辑实验室已经实现无活体雄鼠化模式(或少量)。但使用IVF获得双原核胚胎至少需要8 h，对后续实验的连续性影响很大，本文针对这一关键点，对B6小鼠原核胚冻融后的存活率、注射存活率及2细胞发育率做了相关实验比较，探讨IVF结合胚胎冷冻技术应用于Cas9显微注射的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠，5只，10周龄，体重25～28 g；SPF级雌性C57BL/6J小鼠，40只，3～4周龄，体重11～13 g，均购自南京医科大学实验动物中心[SCXK(苏)2016-0002]。雄鼠单只饲养，雌鼠适应光照周期1周，饲养与实验均在南京医科大学实验动物中心屏障环境[SYXK(苏)2016-0016]，环境温度20℃～26℃，湿度40%～70%，光照周期12 L:12 D,光照时间08:00～20:00。动物实验方案经过南京医科大学实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。……