刘盛华 刘小利 李彬

基础研究

不同剂量熊果酸对大鼠静脉桥再狭窄过程中细胞凋亡的影响

刘盛华 刘小利 李彬

目的 研究不同剂量的熊果酸诱导大鼠静脉桥再狭窄过程中内膜和中膜细胞凋亡的作用。方法 SD大鼠60只，体重300～350 g，随机分成UA（熊果酸）0组、UA1组、UA2组和UA3组。将所有实验动物的右侧颈外静脉以套管法移植至右侧颈总动脉上。UA1组、UA2组和UA3组术后首日开始予以熊果酸灌胃，剂量分别为 15 mg·kg-1·d-1、30 mg·kg-1·d-1和 45 mg·kg-1·d-1，UA0 组不予熊果酸干预。术后满第 1 周、第2周和第4周分三次取材，每次每组随机选取5只大鼠。每条静脉标本随机选取不同位置的切片共5张做TUNEL检测。计算凋亡细胞指数。将4组数据对比研究。结果 1周、2周、4周静脉桥内膜细胞凋亡指数：UA0 组 （22.0±4.1）%、（18.6±2.8）%、（8.4±3.6）%，UA1 组 （28.4±2.4）%、（19.2±1.4）%、（9.4±3.5）%，UA2 组（35.2±1.7）%、（25.6±2.7）%、（11.6±2.7）%，UA3 组（41.5±1.9）%、（28.4±1.8）%、（16.3±1.4）%。1 周、2 周、4 周静脉桥中膜细胞凋亡指数：UA0组（4.0±2.2）%、（2.6±1.5）%、（2.0±0.7）%，UA1组（6.6±2.3）%、（4.2±1.6）%、（2.6±1.1）%，UA2 组（7.8±3.7）%、（4.4±2.1）%、（3.4±1.1）%，UA3 组（7.6±1.7）%、（4.0±0.8）%、（3.5±0.7）%。内膜细胞凋亡指数比较，时间效应的P＜0.05，组别效应的P＜0.05，交互效应的P＜0.05。中膜细胞凋亡指数比较，时间效应的P＜0.05，组别效应的P＞0.05，交互效应的P＞0.05。结论 熊果酸具有诱导大鼠静脉再狭窄的内膜细胞凋亡的作用，该作用随着熊果酸剂量的增大而加强；而熊果酸不具有诱导静脉桥中膜细胞凋亡的作用。

熊果酸； 静脉桥；再狭窄；凋亡

冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft，CABG）是冠心病患者冠状动脉再血管化的重要方法之一。桥血管的通畅率是评价其治疗效果最重要的指标。循证医学资料均显示，静脉桥的通畅率仍无法令人满意，长期效果明显不如乳内动脉。目前认为，再狭窄是由于术中损伤大隐静脉，术后血管内压力改变后释放炎性物质，术后内膜细胞增生、血管重塑等各种因素所导致的结果[1]。熊果酸（ursolic acid，UA），分子式为 C30H48O3，又名乌索酸、乌苏酸[2]。熊果酸是广泛存在于自然界中的α-香树脂醇型五环三萜类化合物。研究表明，熊果酸能够较强地抑制体外培养增殖期的血管内皮细胞，其抑制程度与熊果断的浓度呈正相关[3]。本研究通过建立大鼠静脉桥再狭窄的动物实验模型，术后予以不同剂量的熊果酸干预，同时设立对照组，术后将四组大鼠静脉桥切片进行TUNEL检测，对比研究不同剂量的熊果酸对大鼠静脉桥内膜和中膜细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD大鼠60只，雌雄不拘，体重在300～350 g之间。均购自南方医科大学实验动物中心。熊果酸、TUNEL试剂盒、DAB显色剂及二甲苯等实验试剂购自上海逸术生物科技有限公司。

1.2 动物分组 实验大鼠60只，随机分为UA0组、UA1组、UA2组和UA3组，每组15只。UA0组为对照组，在术后不予熊果酸干预，UA1组、UA2组、UA3组术后给予不同剂量的熊果酸干预。

1.3 大鼠静脉桥再狭窄模型的建立 术前对实验大鼠予以禁食。将所有实验动物的右侧颈外静脉以套管法移植至右侧颈总动脉上。

1.4 术后药物干预 术后在SPF级动物实验室饲养。所有实验大鼠在术后首日开始肌肉注射青霉素钠4万U/d，至术后5天停用。同时予以阿司匹林10 mg·kg-1·d-1，灌胃，直至大鼠取出标本处死。UA0组为对照组，在术后不予熊果酸干预。UA1组术后首日开始予以熊果酸 15 mg·kg-1·d-1，UA2 组术后首日开始予以熊果酸 30 mg·kg-1·d-1，UA3 组术后首日开始予以熊果酸45 mg·kg-1·d-1。给药途径为灌胃。

1.5 静脉标本的采集 术后满第1周、第2周和第4周共分为三次取桥静脉标本，每次在各组大鼠中随机选取5只。麻醉后分离静脉桥，观察桥静脉是否通畅，然后再切取静脉。

1.6 切片染色 每条桥静脉随机选取不同位置的切片共5张，静脉桥切片的厚度为4 μm。分别做TUNEL检测。

1.7 凋亡细胞指数的计算 每张静脉桥切片在400倍光镜下观察，随机选取内膜和中膜处的5个视野，计算各个视野下细胞总数和凋亡细胞数。计算凋亡细胞指数（凋亡细胞指数=阳性细胞数/细胞总数×100%）。数据进行统计学分析。

1.8 统计学方法 凋亡指数采用SAS 8.0分析，计量资料数据采用±s表示，四组静脉桥之间的凋亡指数比较采用析因设计的方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

各组切片TUNEL检测结果见图1～4。各组静脉桥内膜细胞和中膜细胞凋亡指数比较见表1、2表1显示内膜细胞凋亡指数比较，时间效应（由于标本不同的采集时间决定的效应）的P＜0.05，组别效应（由于不同熊果酸剂量所决定的效应）的P＜0.05，交互效应（由于不同熊果酸剂量及标本不同采集时间共同决定的效应）的P＜0.05。表2显示中膜细胞凋亡指数比较，时间效应的P＜0.05，组别效应的 P＞0.05，交互效应的 P＞0.05。

表1 四组桥静脉不同时间点静脉桥内膜细胞凋亡指数比较（%，±s）

表1 四组桥静脉不同时间点静脉桥内膜细胞凋亡指数比较（%，±s）

注：与 UA0组相比，aP＜0.05；与 UA1组相比，bP＜0.05；与 UA2 组相比，cP＜0.05

4周内膜细胞凋亡指数UA0 组 22.0±4.1 18.6±2.8 8.4±3.6 UA1 组 28.4±2.4a 19.2±1.4a 9.4±3.5aUA2 组 35.2±1.7b 25.6±2.7b 11.6±2.7bUA3 组 41.5±1.9c 28.4±1.8c 16.3±1.4c组别 1周内膜细胞凋亡指数2周内膜细胞凋亡指数

本实验表明，四组静脉桥在不同时间所取的标本内膜和中膜均能见到凋亡细胞。三种不同剂量的熊果酸均具有诱导内膜细胞凋亡的作用，该作用随着剂量的增加而加强。三种不同剂量的熊果酸均没有诱导中膜细胞凋亡的作用。

表2 四组桥静脉不同时间点静脉桥中膜细胞凋亡指数的比较（%，±s）

表2 四组桥静脉不同时间点静脉桥中膜细胞凋亡指数的比较（%，±s）

组别 1周内膜细胞凋亡指数4周内膜细胞凋亡指数UA0 组 4.0±2.2 2.6±1.5 2.0±0.7 UA1 组 6.6±2.3 4.2±1.6 2.6±1.1 UA2 组 7.8±3.7 4.4±2.1 3.4±1.1 UA3 组 7.6±1.7 4.0±0.8 3.5±0.7 2周内膜细胞凋亡指数

3 讨论

尽管临床上大多数冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者会选择经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）完成冠状动脉血运重建。但冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft，CABG）仍然是冠状动脉再血管化的最重要的外科方法，尤其是对于PCI失败或PCI术后再狭窄的患者。对于冠状动脉再血管化的方法，桥血管的通畅率是评价其治疗效果最重要的指标。左乳内动脉（left internal mammary artery，LIMA）由于其自身为动脉组织，由于其特殊的解剖位置，一直以来都是心外科医生首选的桥血管。但是当需要多支桥血管或LIMA由于狭窄等原因无法应用时，大隐静脉（great saphenous vein，GSV）则可作为较佳的桥血管，其位置比较表浅，取材相对方便，同时其直径适宜。多年来GSV在临床上得到了广泛的应用。循证医学资料显示，乳内动脉吻合前降支（LIMALAD），10年的通畅率达到了90%以上[4]。而大隐静脉10年通畅率仅为50%～60%[5]，大隐静脉长期通畅率显然低于乳内动脉。目前认为，再狭窄是由于术中损伤大隐静脉，术后其由静脉压力变为动脉压力环境的改变导致释放炎性物质，术后内膜细胞增生、血管重塑等各种因素所导致的结果。

熊果酸是广泛存在于自然界中的α-香树脂醇型五环三萜类化合物。其为脂溶性物质，易溶于甲醇、吡啶等物质，可透过细胞膜发挥药理作用，具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤等较为广泛的生物学作用，目前已广泛用于化妆品及医药行业。研究表明，熊果酸能够较强地抑制体外培养增殖期的血管内皮细胞，其抑制程度与熊果断的浓度呈正相关[3]。熊果酸具有抑制NF-κB的活化。NF-κB作为介导炎症及免疫反应的中心物质，在血管组织增生、细胞氧化、组织炎症反应及细胞凋亡中都具有重要的介导作用。NF-κB是介导炎症及免疫反应的中心物质，同时也是细胞凋亡信号传导通路中重要的转录调节因子，几乎存在于所有的细胞中。作者前期研究表明，熊果酸可能通过抑制炎症反应的中心物质NF-κB 的活化，进而抑制 MCP-1、IL-1α、IL-6 及TNF-α的表达。总之，熊果酸可以抑制术后静脉桥血管的狭窄[6]。

熊果酸抑制术后静脉桥血管再狭窄，是由抑制局部炎症、诱导细胞凋亡等多种因素作用的结果。目前对于熊果酸诱导细胞凋亡的作用多集中在抑制肿瘤的作用上。研究表明，经熊果酸处理48 h后，人肺癌细胞PGCL3细胞凋亡率与对照组比较显著升高[7]。Baek等[8]的研究证实，熊果酸能显著抑制人白血病细胞HL-60的增殖，诱导HL-60细胞凋亡，并且具有浓度依赖型。本研究表明，熊果酸具有明显的诱导大鼠静脉再狭窄的内膜细胞凋亡的作用。该作用随着其剂量的增加而加强，浓度依赖性明显。而熊果酸不具有诱导静脉桥中膜细胞凋亡的作用。随着对熊果酸抑制静脉桥再狭窄作用机制研究的深入，熊果酸药理作用的理论基础必然会更加完善。

图1 UA0组第1、2、4周静脉桥切片TUNEL检测（×400）

图2 UA1组第1、2、4周静脉桥切片TUNEL检测（×400）

图3 UA2组第1、2、4周静脉桥切片TUNEL检测（×400）

图4 UA3组第1、2、4周静脉桥切片TUNEL检测（×400）

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Study of ursolic acid induce vein cells apoptosis in rats vein graft restenosis model with different doses of urslic acid

LIU Sheng-hua＊，LIU Xiao-li，LI Bin.＊Department of Cardiothoracic Surgery，Armed Police Corps Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510000，China

ObjectiveTo study the induction of vein intimal and media cells apoptosis in rats vein graft restenosis model with different doses of ursolic acid.Methods60 SD rats，weighing 300-350 g，were randomly divided into group UA0，group UA1，group UA2 and group UA3.The right external jugular veins were grafted into the right carotid artery with cuff technique for 60 rats.Ursolic acid 15 mg·kg-1·d-1was administrated daily in rats of group UA1.Ursolic acid 30 mg·kg-1·d-1was administrated daily in rats of group UA2.Ursolic acid 45 mg·kg-1·d-1was administrated daily in rats of group UA3.Group UA0 not ursolic acid intervention.Samples of veins tissues were harvested at 1，2，4 weeks.5 rats were randomly selected each time and each group.5 slices at different positions were randomly selected in each vein samples.Apoptotic index were calculated after TUNEL test.Apoptotic index of 4 groups was compared.ResultsApoptotic index of intimal cells of one week，two weeks and four weeks：group UA0 （22.0±4.1）%，（18.6±2.8）%，（8.4±3.6）%，group UA1（28.4±2.4）%，（19.2±1.4）%，（9.4±3.5）%，group UA2（35.2±1.7）%，（25.6±2.7）%，（11.6±2.7）%，group UA3（41.5±1.9）%，（28.4±1.8）%，（16.3±1.4）%.Apoptotic index of media cells of one week，two weeks and four weeks：group UA0 （4.0±2.2）%，（2.6±1.5）%，（2.0±0.7）%，group UA1（6.6±2.3）%，（4.2±1.6）%，（2.6±1.1）%，group UA2（7.8±3.7）%，（4.4±2.1）%，（3.4±1.1）%，group UA3 （7.6±1.7）%，（4.0±0.8）%，（3.5±0.7）%.Comparison of apoptotic index of intimal cells，the time effect was P＜0.05，the group effect was P＜0.05，the interaction effect was P＜0.05.Comparison of apop－totic index of media cells，the time effect was P＜0.05，the group effect was P＞0.05，the interaction effect was P＞0.05.ConclusionUrsolic acid has the effect of inducing intimal cells apoptosis in rats with venous restenosis.This effect enhanced with increasing ursolic acid dose.While ursolic acid has not the effect of inducing media cells apoptosis.

Ursolic acid； Vein graft； Restenosis； Apoptosis

广东省医学科学技术研究基金项目（项目编号：A2016482）

510000 广东省广州市，武警广东省总队医院心外科（刘盛华、李彬）；广州中医药大学第一附属医院儿科（刘小利）

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．03．024

Q95-33；R654.2

A

1672-5301（2017）03-0284-03

2016-12-11）