徐雅丽张正清刘 悦丁之德*

1. 上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系（上海 200025）

2. 上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科

·论 著·

肥胖与雄性小鼠生殖系统慢性炎症的相关性研究

徐雅丽1张正清2刘 悦1丁之德1*

1. 上海交通大学医学院解剖学与组织胚胎学系（上海 200025）

2. 上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科

目的研究肥胖诱导的雄性小鼠生殖系统炎症反应以及相关分子机制。方法建立肥胖小鼠模型。通过Real-time PCR检测其睾丸和附睾内促炎细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子- α（tumor necrosis factor，TNF-α），炎症小体3（NOD-like receptor family pyrin domain containing-3，NLRP3）的mRNA表达水平，运用HE染色观察肥胖小鼠睾丸组织的结构变化，采用ELISA实验检测小鼠血清中性激素，IL-6，TNF-α，皮质酮，免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）以及免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）浓度变化，最后通过Western blot检测肥胖小鼠睾丸中炎症反应相关信号通路蛋白p38，核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）, 细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），c-Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）的含量变化。结果与正常组小鼠相比，肥胖小鼠睾丸和附睾内IL-6，TNF-α和NLRP3的含量显著上升，肥胖小鼠血清中性激素水平紊乱，表现为雌激素水平上升，睾酮和孕酮水平下降。血清中IL-6、TNF-α、皮质酮、IgG和 IgM浓度也明显增高。此外，肥胖小鼠睾丸发育异常，且睾丸中p38、NF-κB、ERK和JNK含量显著上升。结论肥胖会诱导雄性小鼠睾丸和附睾发生炎症反应，而该炎症反应可导致小鼠生育力的损伤。

小鼠, 肥胖; 睾丸 ; 附睾; 炎症; 生育力

肥胖是一个全球性的健康问题，在过去几年中，肥胖的患病率大幅上升，2013年的调查数据显示，世界范围内，超质量和肥胖的人口数从1980年的8.57亿上升到21亿，其中超质量男子的比例从1980年的28.8%上升到36.9%[1]。肥胖是一种行为和遗传因素共同作用所导致的代谢性疾病，并与一些慢性疾病息息相关，包括代谢综合征、高血脂、糖尿病、癌症以及不孕症等[2]。另一方面，过去几年的调查显示脂类代谢与机体的免疫功能关系密切[3]，并且这种代谢与免疫系统之间的相互作用是由免疫细胞和脂肪细胞共同调控[4]。研究表明，脂肪细胞功能紊乱很可能会引起全身性的炎症反应[5]，并且肥胖与一种慢性炎症反应有关，这种炎症反应的特征是促炎细胞因子，如肿 瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）等的分泌异常，以及促炎症信号通路的激活[4]。有文献报道，啮齿动物的脂肪细胞可以直接分泌TNF-α从而导致肥胖个体炎症反应的发生，这一发现与人类研究中显示肥胖个体的脂肪组织中TNF-α含量增加，减肥后TNF-α随之下降的现象相一致[6]。此外，炎症小体3（NOD-like receptor family pyrin domain containing-3, NLRP3，NLRP3）炎症小体也与肥胖和肥胖引起的炎症反应密切相关[7]。

近年来，有多项研究发现男性肥胖会降低精子质量，进而损害男性生育力[8-10]。然而，肥胖是如何对精子产生影响及其影响的机制如何？现有的文献并无明确的答案。因此，本研究通过高脂饮食构建肥胖小鼠模型模拟人类由不良生活方式所致的肥胖症；其后通过观察分析雄性肥胖小鼠睾丸组织结构的变化，并进一步检测睾丸和附睾等组织和血清中促炎细胞因子的表达水平及其相关信号通路来探讨肥胖所致慢性炎症对雄性生殖的不良影响。

材料与方法

一、实验动物与材料

雄性C57BL/6小鼠，3周龄，订购于上海斯莱克实验动物有限公司。10% fat Kcal%的对照组饲料（MD12031）和45% fat Kcal%的高脂组饲料（MD12032）订购于江苏美迪森公司。

二、主要试剂与仪器

（一）试剂

Trizol（Invitrogen），逆转录酶DRR037A（TaKaRa），SYBR Premix Ex Taq (2x)（TaKaRa），ROX Reference Dye II （TaKaRa），雄激素检测试剂盒（R&D Systems），雌激素检测试剂盒（Cayman chemical），孕酮检测试剂盒（Cayman chemical），皮质酮检测试剂盒（ALPCO），IgG 检测试剂盒（ICL），IgM检测试剂盒（ICL），TNF-α检测试剂盒 (Anogen)，IL-6检测试剂盒 (Anogen)，RIPA lysis buffer（Thermo Fisher Scientific），Protease Inhibitor tablet（Thermo Fisher Scientific），兔抗鼠actin抗体（Cell Signaling Technology），兔抗鼠p38抗体（Cell Signaling Technology），兔抗鼠NF-κB抗体（Cell Signaling Technology），兔抗鼠JNK抗体（Cell Signaling Technology），兔抗鼠ERK抗体（Cell Signaling Technology），辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（Abgent）。

（二）仪器

数码显微镜（Nikon E600），生化自动分析仪（Roche Diagnostics），Applied Biosystems 7500（Thermo Fisher Scientific），全波长酶标仪 Multiskan GO（Thermo Fisher Scientifc），1000/500型电泳仪和转移仪（Bio-Rad），凝胶图像分析系统（Bio-Rad）。

三、方法

（一）肥胖小鼠模型构建

购置3周龄C57BL/6雄鼠60只于医学院实验动物科学部饲养。将60只鼠随机分为两组，即正常饮食对照组（control diet，CD）和高脂饮食组（high-fat diet，HFD），每组各30只，且每笼中的小鼠均用苦味酸标记，用以观察不同组小鼠体质量的改变。两组小鼠在适应性喂养1周后，CD组继续给予正常饲料，而HFD组则给予高脂饲料，两组小鼠每周测量体质量一次并记录，与此同时，记录两组小鼠每周摄食饲料的质量，直至第14周。

（二）小鼠肝脏和睾丸形态学观察

成功构建肥胖小鼠模型后，对其过量麻醉处死，取其肝脏和睾丸组织并浸入Bouin氏液中固定过夜。后经梯度乙醇脱水后进行石蜡包埋，二甲苯脱蜡后梯度乙醇复水，室温晾干后HE染色等步骤，最终经中性树胶封片后置于数码显微镜下观察并拍照。

（三）小鼠血脂水平检测

小鼠麻醉后心脏取血，室温静置30 min后，置于小型台式离心机中4 ℃，845×g，离心15min，吸取血清，分装后置于-80 ℃低温冰箱保存。待所有的血清收集完毕后送上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科检测血脂水平。

（四）实时荧光定量PCR

采用Trizol法分别提取睾丸、附睾头部和附睾尾部的总RNA，并用RT Master Mix试剂盒反转录成cDNA。引物设计采用PRIMER 5.0软件，IL-6引物：上游引物5’-TTCTTGGGACTGATGCTGGT-3’，下游引物5’-CCTCC-GACTTGTGAAGTGGT-3’；TNF-α引物：上游引物5’-ACGGCATGGATCTCAA A G A C-3’，下游引物5’- G T G G G T GAGGAGCACGTAGT-3’；NLRP3引物：上游引物5’-CATCAATGCTGCTTCGACAT-3’，下游引物5’-T C A G T C C C A C A C AC A G C A AT-3’；β-a c t i n引物：上游引物5’-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3’，下游引物5’-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3’。检测系统为Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR，反应条件为：stage1 预变性，Reps: 1, 95°C 30s；stage2 PCR反应，Reps: 40, 95°C 5s, 60°C 34s；Dissociation Stage。通过实验测定的Ct值表示目的基因mRNA表达量，实验组和对照组目的基因表达量的相对变化水平使用2-△△Ct法分析表示。

（五）ELISA检测小鼠血清中激素、IL-6、TNF-α、IgG和IgM水平

小鼠麻醉后心脏取血，室温静置30min后，4℃，845×g，离心15min，吸取血清。向预先包被有待测激素、IgG、IgM、TNF-α和IL-6抗体的96孔板中分别加入封闭液封闭孔中多余的蛋白结合位点，随后，在孔中加入血清，待抗体吸附血清中的抗原且经PBS缓冲液洗涤后，再向孔中加入生物素标记的抗体吸附已结合的抗原，然后将链霉亲和素-HRP加入待测孔结合生物素标记的抗体，最后加入四甲基联苯胺底物与HRP进行显色，通过酶标仪检测吸光度获得样本数据。

（六）Western法检测相关蛋白表达水平

小鼠过量麻醉处死后，取一侧睾丸置于匀浆器，使用RIPA裂解液抽提睾丸蛋白，采用BCA法检测睾丸蛋白浓度。取30μg样品蛋白进行SDS-PAGE电泳（浓缩胶90 V，约30 min；分离胶120 V，约1h），电泳后转膜（350 mA, 90 min）。经5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，加稀释后一抗（actin 1:1000，p38 1:1000, NF-κB 1:1000, JNK 1:1000, ERK 1:1000）孵育过夜，随后洗涤去除一抗，加1:10000羊抗兔二抗室温孵育1 h，洗涤。用凝胶图像分析系统曝光待测蛋白得到目的蛋白条带图。

（七）统计学分析

采用SAS 8.2统计软件进行数据处理，应用单因素方差分析对每组数据进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组小鼠体质量、摄食量、肝脏形态及血脂水平分析

雄性C57BL/6小鼠在高脂饮食喂养10周后（鼠龄14周），与CD组小鼠相比体质量呈现显著增加，而HFD组小鼠每周的摄食量均少于CD组。CD组与HFD组小鼠的体质量在喂养4周后（鼠龄第8周）便开始出现差异，分别为（26.29±1.05）g和（31.63±1.96）g，差异具统计学意义（P＜0.05），且该差异随喂养时间的延长愈加显著（图1A，图1B）。

小鼠肝脏切片HE染色的形态学分析显示，与CD组相比，HFD组小鼠肝脏的肝细胞均出现脂肪空泡化现象，表现为严重的脂肪肝病变（图1C）。

图1 CD组和HFD组小鼠每周体质量、摄食量及肝脏HE切片

血脂水平分析表明：HFD组小鼠血清总胆固醇（CHOL）水平为（4.36±0.11）mmol/L，高密度脂蛋白（HDL）水平为（2.16±0.04）mmol/L，低密度脂蛋白（LDL）水平为（0.47±0.06）mmol/L，与CD组（分别为（2.30±0.11）mmol/L，（1.47±0.07）mmol/L和（0.26±0.02） mmol/L）比较均显著上升，差异均具统计学意义（P＜0.01）；但两组的甘油三酯（TGL）水平相比差异无统计学意义（P＞0.05），HFD组和CD组的TGL水平分别为（1.19±0.05）mmol/L和（1.16±0.10）mmol/L。此外，HFD组和CD组的载脂蛋白B（ApoB）浓度分别为（0.08±0.03）g/L和（0.05±0.007）g/L，载脂蛋白E（ApoE）浓度分别为（5.18±0.86）mg/dL和（2.46±1.00）mg/dL，HFD组均表现显著上升，与CD组比差异有统计学意义（P＜0.01，图2）。

二、小鼠血清性激素水平变化

ELISA结果显示：HFD组小鼠血清中雌激素水平[（16.74±1.06）pg/mL]，与CD组（9.14±2.58）pg/mL相比，显著上升；睾酮水平[（4.58±1.44）ng/mL]，与CD组（7.95±0.80）ng/mL相比，显著降低，差异均具统计学意义（P＜0.01）；同时孕酮水平[（10.38±1.43）pg/mL]，与CD组（12.76±1.62）pg/mL相比，也显著降低，差异具统计学意义（P＜0.05，图3）。

图2 CD组和HFD组小鼠血脂水平的变化

图3 CD组和HFD组小鼠性激素水平变化

三、两组小鼠睾丸形态学分析以及IL-6、TNF-α和NLRP3 mRNA在小鼠睾丸和附睾中相对表达水平变化

小鼠睾丸切片HE染色的形态学分析显示，HFD组小鼠的生精上皮严重萎缩，且支持细胞和生精细胞之间的细胞连接被破坏，排列松散（图4）。同时，Real-Time PCR结果显示，与CD组相比（相对表达量取为1），HFD组小鼠睾丸IL-6的mRNA表达水平（3.7±0.83），TNF-α的mRNA表达水平（2.24±0.50）和NLRP3的mRNA表达水平（2.42±0.51）；HFD组小鼠附睾头部IL-6的mRNA表达水平（3.05±0.79），TNF-α的mRNA表达水平（1.90± 0.17）和NLRP3的mRNA表达水平（1.51±0.16）；HFD组小鼠附睾尾部IL-6的mRNA表达水平（3.85±0.71），TNF-α的mRNA表达水平（2.80±0.61）和NLRP3的mRNA表达水平（2.45±0.20）均有显著上升，差异均具统计学意义（P＜0.05，图5）。

图4 CD组和HFD组小鼠睾丸HE切片

图5 CD组和HFD组小鼠睾丸和附睾内IL-6、TNF-α和NLRP3 mRNA相对表达水平

四、两组小鼠血清IL-6、TNF-α、皮质酮以及IgG、IgM水平变化

ELISA结果显示：HFD组小鼠血清中IL-6和TNF-α浓度分别为（9.50±0.43）pg/mL和（30.91±2.03）pg/mL，与CD组[IL-6和TNF-α浓度分别为（5.37±0.32）pg/mL和（18.18±0.59）pg/mL]相比，显著升高，差异均具统计学意义（P＜0.01）。HFD组的皮质酮和IgG浓度也显著上升，分别为（165.75±10.68）ng/mL和（6227.40±713.48）μ g/m L，与C D组[皮质酮和I g G浓度分别为（115.93±10.47）ng/mL和（3620.39±439.70）ng/mL]相比，差异均具统计学意义（P＜0.01）。两组的IgM浓度无显著变化（图6）。

五、肥胖对炎症反应信号通路相关蛋白含量的影响

P38, NF-κB, JNK和ERK均为TNF-α下游的重要信号分子，也是在免疫反应中研究较多的具有代表性的重要信号蛋白，并且也与雄性动物血睾屏障的完整性密切相关。Western blot实验结果显示，与CD组小鼠相比，HFD组小鼠睾丸内，P38, NF-κB, JNK和ERK表达水平均显著上升（图7）。

讨 论

我们在前期的研究中已经证实了高脂饮食诱导的肥胖会损害雄鼠的精子功能，进而损伤雄性的生育力[11,12]。为了明确肥胖是否通过引起雄鼠生殖道炎症进一步影响其生育力这一设想，我们首先构建肥胖小鼠模型，经过10周的高脂喂养，HFD组小鼠呈现出明显的体质量上升，脂肪肝病变以及血脂中胆固醇、低密度脂蛋白及载脂蛋白B和E等水平显著上升。然而血清甘油三酯水平并未上升，推测主要因素是给予小鼠的高脂饲料中其主要脂类成分为猪油，而猪油中含有大量的胆固醇，因此相比较于正常小鼠，肥胖小鼠的血清总胆固醇有显著性升高；而另一方面，受即食影响的血清甘油三酯水平却无明显变化，这也进一步说明我们建立的肥胖小鼠模型是一个脂类代谢长期紊乱的表型。其次，伴随肥胖，小鼠出现内分泌紊乱即性激素水平异常的现象。性激素水平检测结果显示，肥胖小鼠的雌激素水平显著升高，而雄激素与孕酮水平显著降低。研究发现，性类固醇激素如雌激素、睾酮和孕酮有许多重要的生理功能，包括生殖、细胞增殖、细胞凋亡以及对微生物和病毒感染的反应[13]。此外，性类固醇激素对免疫细胞的活性有显著的调节作用，如睾酮能降低促炎细胞因子TNF-α的合成[14]，雌激素通过刺激促炎细胞因子IL-6和TNF-α来增强细胞和体液免疫反应[15,16]，另外孕酮对NF-κB的激活有显著的抑制作用[17]。与之相对应的是，我们通过荧光定量PCR检测小鼠睾丸和附睾内的促炎细胞因子水平，结果显示IL-6，TNF-α和NLRP3的表达水平在肥胖小鼠中均有显著升高，同时，ELISA实验结果表明肥胖小鼠血清中的IL-6和TNF-α浓度也有明显的上升。除此外，与正常小鼠相比，肥胖小鼠血清中的皮质酮和IgG浓度均有显著增高。在机体受感染时，炎症反应会通过激活下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴促进肾上腺皮质分泌大量皮质酮，这是机体在感染应激时发生的重要生理反应[18]，皮质酮可以通过抑制促炎介质的表达或刺激抗炎介质的表达而发挥抗炎作用[19]。因此，这一结果进一步验证了肥胖会导致小鼠机体炎症反应的发生。一般状况下，IgM是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，多产生于早期感染阶段，当机体处于急性炎症反应阶段时体内IgM浓度较高，而IgG是再次免疫应答产生的主要抗体，多产生于感染后期，即慢性炎症反应阶段[20]。在我们的研究中发现，与正常小鼠相比，肥胖小鼠血清中IgM含量并无显著性改变，而IgG含量较高，故肥胖诱导小鼠机体产生的炎症反应为慢性炎症反应而非急性炎症反应。

图6 CD组和HFD组小鼠血清中IL-6、TNF-α、皮质酮、IgG和IgM浓度变化

图7 CD组和HFD组小鼠睾丸中炎症反应相关蛋白表达水平的变化

为了进一步探讨肥胖引起的炎症对雄性小鼠生育力的影响，我们对小鼠睾丸进行了HE染色分析，结果显示肥胖小鼠睾丸生精小管内生精上皮严重萎缩，并且支持细胞和生精细胞间的细胞连接被破坏，排列松散。因此，高脂饮食所诱导的小鼠肥胖会导致全身包括生殖道的炎症反应，其结果可使肥胖小鼠的睾丸发育出现异常。

大量研究显示TNF-α在对炎症反应发生过程[21]和炎症反应信号通路中的其他分子，如p38、NF-κB、JNK和ERK等激活过程有着重要作用[3]。另一方面，在小鼠的支持细胞中，TNF-α通过激活NF-κB诱导Fas表达上调，Fas又称APO-1（apoptosis-1），是位于细胞膜上的一个受体，可以启动凋亡信号的转导，触发细胞凋亡从而导致血睾屏障损伤[22]。此外，在小鼠睾丸中，有丝分裂原活化蛋白酶（MAPK）与血睾屏障结构的完整性也密切相关，而MAPK这一反应途径具有3个分支的级联反应，这3个分支包括p38、ERK和JNK 3条信号通路[23]。在我们的研究中，雄性肥胖小鼠睾丸内的p38、NF-κB、JNK和ERK蛋白水平明显高于正常组小鼠，表明肥胖诱导的生殖系统炎症反应可造成睾丸内除促炎细胞因子TNF-α水平上升。TNF-α水平上升后，可诱导其下游信号分子p38、NF-κB、JNK和ERK蛋白表达水平升高，而这些蛋白均与血睾屏障的完整性密切相关。此外，在我们的前期研究[11]显示：相比于正常小鼠，肥胖小鼠的血睾屏障完整性受损，且与雌鼠交配后产仔率显著下降。因此可推测，炎症除导致肥胖小鼠睾丸内TNF-α水平上升外，可进一步引起p38、NF-κB、JNK和ERK蛋白水平升高，其结果会造成血睾屏障结构的完整性被破坏，损伤其生精功能，最终导致雄性小鼠生育力下降。因此，通过本项研究对肥胖诱导的雄性生殖系统炎症反应及机制进行探讨，可为今后更全面深入阐明肥胖对雄性生育力的调控提供了新的理论基础和重要的实验依据。

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（2017-03-08收稿）

The correlation between obesity and inflammation in male mice genital tract

Xu Yali1, Zhang Zhengqing2, Liu Yue1, Ding Zhide1*
1. Department of Anatomy, Histology and Embryology, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China; 2. Department of Clinical Laboratory, Shanghai 9th People's Hospital Corresponding author: Ding Zhide, E-mail: zding@shsmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the infammatory situation in obesity-induced male genital tract, and analyze its related mechanisms.MethodsThe obese mouse model was established by high fat diet. The expressions of IL-6、TNF-α and NLRP3 in testis and epididymis were detected by real-time PCR. Morphology of testis were observed by histological analysis. The concentration of sex hormones,IL-6,TNF-α,corticosterone,IgG and IgM in serum were detected by ELISA and the expressions of p38、NF-κB、ERK and JNK in testis were analyzed by western blot.ResultsCompared with those in the normal diet control group, the levels of IL-6,TNF-α and NLRP3 were remarkably increased in obese mice' testis and epididymis. Moreover, there was a disorder of sex hormones including decrease of testosterone and progesterone and increase of estradiol. On the other hand, the concentration of IL-6, TNF-α, corticosterone, IgG and IgM in serum were higher in obese mice than those in the controls. Besides, testes morphological analysis of obese mice exhibited an abnormal testicular structure. Meanwhile, P38, NF-κB, JNK and ERK expressions were increased in testicular tissue of obese mice in response to high-fat treatment.ConclusionObesity might result in the infammation in male genital tract, which could impair male fertility.

mice, obese; testis; epididymis; infammation; fertility

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.03.001

R589.25; R698

*通讯作者, E-mail: zding@shsmu.edu.cn