谢恒韬　潘侠　何旋

[摘要] 目的 观察不同剂量的丙泊酚对大鼠下丘脑垂体、海马Akt以及海马淀粉样β蛋白的影响。 方法 雄性SPF级SD大鼠24只，采用大鼠尾部静脉注射的方式，较小剂量分次尾部静脉注射的方法，注射共3次。每次剂量为10 mg/mL，根据累积剂量分为丙泊酚Ⅰ组（10 mg/mL），丙泊酚Ⅱ组（20 mg/mL）和丙泊酚Ⅲ组（30 mg/mL），对照组不进行麻醉处理，每组各6只。脑电图仪检测大鼠的脑电信号，HE染色观察大鼠下丘脑弓状核神经元和垂体促性腺细胞病理学变化，Western blot检測各组大鼠海马Akt及淀粉样β蛋白（Aβ）表达水平。结果 与对照组比较，棘波、α波和β波随着丙泊酚剂量的增加而显著增加（P < 0.05），δ波随着丙泊酚剂量的的增加而显著降低（P < 0.05）；对照组的下丘脑弓状核神经元密度和分布正常，腺垂体细胞整体数目多，细胞间有丰富的窦状毛细血管，细胞排列规则；丙泊酚Ⅰ组的大鼠弓状核神经元无明显病变，腺垂体细胞也并无出现明显的降低；随着剂量的增加，丙泊酚Ⅱ组和丙泊酚Ⅲ组下丘脑神经元细胞和垂体细胞数量明显减少，核膜界限不清，细胞排列不规则增加；Western blot结果显示，与对照组相比，随着丙泊酚剂量的增加，海马内的Akt蛋白表达呈降低趋势（P < 0.01），Aβ表达明显增加（P < 0.01）。 结论 低剂量丙泊酚不足以促使下丘脑和垂体发生病变，当丙泊酚剂量增大时，下丘脑和腺垂体反馈作用增强，导致病理变化的发生，丙泊酚麻醉对β淀粉样蛋白沉积作用可能是通过抑制Akt途径实现的。

[关键词] 丙泊酚；下丘脑；垂体；淀粉样β蛋白

[中图分类号] R614 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0024-04

[Abstract] Objective To observe the effects of different Propofol anesthesia doses on rat hypothalamus， pituitary， hippocampus Akt and amyloid beta protein （Aβ）. Methods 24 SPF grade male rats were used by method of low-dose tail intravenous injection （10 mg/mL） for 3 times. The rats were divided into 4 groups by methods of cumulative dose， control， Propofol group Ⅰ （10 mg/mL）， Propofol group Ⅱ （20 mg/mL） and Propofol group Ⅲ （30 mg/mL）， respectively. No anaesthetic management was given in control group， with 6 rates in each group. Electroencephalogram was detected by electroencephalograph； the pathology of rat hypothalamic arcuate nucleus neurons and pituitary gonadotropin cell was observed by HE staining. Western blot detection was used to detect the expression of the Akt and Aβ. Results Compared with the control group， the spike wave， α wave and β wave increased significantly with the increase of the Propofol dose （P < 0.05）， and the δ wave decreased significantly with the Propofol dose increasing （P < 0.05）. The density and distribution of hypothalamic arcuate nucleus were normal in the control group， with the large whole number of adenohypophysis cells， abundant sinusoid capillary between cells， and the cells were arranged regularly； no obvious lesions of rats arcuate nucleus neuron in Propofol group Ⅰ was observed， as well as no obvious reduction in adenohypophysis cells. With increasing of dose of anesthesia， the number of hypothalamic neuron cells and adenohypophysis cells reduced significantly， with unclear boundary of nuclear membrane and an increase in the number of irregular arrangement cells. The Western blot results suggested that with increasing of the Propofol dose， the Akt hippocampus protein expression reduced dramatically （P < 0.01） while Aβ expression increased significantly （P < 0.01） in anesthesia group comparing with control. Conclusion Low-dose Propofol anesthesia can not cause lesions in hypothalamus and hypophysis， but their feedback effects enhanced with Propofol dose increasing， causing pathological changes. The deposition effects of Propofol anesthesia on Aβ may be achieved by inhibiting Akt pathway.

[Key words] Propofol； Hypothalamus； Pituitary； Hippocampus amyloid β protein

术后认知功能障碍是麻醉手术患者常见的神经系统并发症。海马在机体的学习、记忆及意识行为等生理过程中起到重要的作用[1-2]，麻醉药对海马的结构和功能有显著的影响作用，其通过调节GABA-A受体抑制长时程增强，进而达到麻醉时的遗忘状态。有研究发现丙泊酚及其他全麻药可使在体记录到的海马脑电反应和诱发电位产生明显的剂量依赖性改变[3-4]。此外，丘脑也是麻醉药发挥作用的主要靶位，皮质环路在麻醉药对感觉信息处理产生影响[5]，而脑下垂体在功能上与下丘脑紧密相连，所以一般将下丘脑与垂体看作为一个完整的功能系统，对靶器官的功能活动进行调节[6-8]。本研究通过不同剂量的丙泊酚麻醉大鼠，观察不同剂量丙泊酚对大鼠下丘脑和垂体的形态学影响，以及大鼠海马内Aβ表达的变化，并研究其可能的作用途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。

SPF级SD大鼠，雄性，月龄4个月，体重在180～220 g，24只大鼠分笼饲养，每笼6只，室温（22±3）℃，自然光照，相对湿度60%～65%，自由饮水和进食。

1.2 药品与试剂

丙泊酚注射液購自美国AstraZeneca公司。羧甲基纤维素钠购自天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司，批号：20090324。磷酸化蛋白富集试剂盒PhosphoProtein Purification Kit购自QIAGEN公司。蛋白质定量试剂盒2DQUANTKIT购自美国GE公司。小鼠抗大鼠keratin 18单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。羊抗大鼠apoE多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。HRP标记的ECL化学发光试剂盒购自美国Amersham Pharmacia公司。

1.3 主要仪器和设备

大鼠尾静脉注射固定简购自德国贝朗医疗有限公司。Milli.Q超纯水仪购自美国Millipore公司。大鼠脑组织分离器械购自美国GE公司。Excelsior TMES自动组织脱水机购自美国 Thermo Scientific公司。垂直电泳系统美国美国GE公司。BH-2型OLYM-PUS 显微镜及摄像装置购自日本Olympus公司。低温离心机美国Sigma公司。漩涡振荡器购自Bio. Rad公司。凝胶图像分析仪Kodak 2000购美国GE公司等。

1.4 麻醉模型的建立

24只大鼠设为4组，每组各6只，本实验采用较小剂量分次大鼠尾部静脉注射的方式，注射共3次。每次剂量为10 mg/mL，在30 min内给药完毕，各次注射后的累积剂量依次为10、20、30 mg/mL，分别设为丙泊酚Ⅰ组，丙泊酚Ⅱ组和丙泊酚Ⅲ组，每天麻醉实验1次，对照组为清醒状态下大鼠，不进行麻醉处理。对照组脑电信号测量时，参考高春芳的方法[9]，取大鼠俯卧位，采用双极导联法，作用电极一极放置在两眼外眦连线中点处，一极放置在两耳廓中部连线中点处，参考电极放置在左侧颈部皮下位置，用自制的银电极刺入皮下并设置倒钩防止脱落。电极插入并待大鼠进入安静状态后采集脑电信号，丙泊酚组大鼠在注射不同剂量丙泊酚的情况下，注射后5 min开始采集，每5分钟测量1次，共采集3次，采用Matlab软件计算各波段的信号值，并求平均值。

1.5 HE染色

连续麻醉10 d后，各组大鼠均于末次麻醉后，开胸，暴露心脏，自左心室升主动脉灌注约250 mL生理盐水，待流出液为无色；继以灌注4%多聚甲醛约300 mL至大鼠变硬。灌注结束后，取脑、垂体，放入4%多聚甲醛进行后固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，光学显微镜下观察下丘脑、垂体形态学变化。

1.6 Western blot法检测海马中Akt和Aβ的表达

连续麻醉10 d后，分离大鼠海马组织，将各组的大鼠海马组织加入含有蛋白酶抑制剂的组织裂解液中进行匀浆处理，将完毕的匀浆液12 000 r/min下离心20 min，之后取上清液，测定总的蛋白浓度。通过调整相同的蛋白浓度后，进行电泳获得分子量分离的蛋白条带，各实验组蛋白液与等体积上样缓冲液混匀袁煮沸3 min，以15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转印蛋白至硝酸纤维素膜。然后将其放在封闭液中封闭2 h，根据Western blot显像试剂盒的指导说明来进行，蛋白的NC膜电转，进行蛋白封闭和一抗孵育标记兔抗大鼠的多克隆抗体。ECL试剂盒显色后，暗室发光拍照，以β-actin为内参进行系统软件分析[10]。

1.7统计学方法

采用统计软件SPSS 11.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用方差齐性检验，方差齐者采用SNK-q检验法，方差不齐者采用Tamhane's T2检验法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同麻醉深度时脑电波频率变化

与对照组比较，棘波、α波和β波随着丙泊酚麻醉深度的增加而显著增加（P < 0.05），δ波随着丙泊酚麻醉深度的增加而显著降低（P < 0.05）。见表1。

2.2 不同剂量丙泊酚对下丘脑弓状核神经元的影响

对照组下丘脑弓状核神经元密度较大，分布均匀，胞核清楚，胞浆染色较深；丙泊酚Ⅰ组大鼠弓状核神经元无明显病变；随着剂量丙泊酚的增加，下丘脑神经元细胞数量明显减少，染色质出现边际化，胞浆尼氏体溶解，核膜界限不清，鬼影细胞出现程度增加。见图1。

2.3 不同剂量丙泊酚对腺垂体细胞结构的影响

对照组腺垂体细胞整体数目多，细胞间有丰富的窦状毛细血管，细胞排列规则；与对照组比较，丙泊酚Ⅰ组的腺垂体细胞并无出现明显的降低；随着丙泊酚剂量的增加，丙泊酚Ⅱ组和丙泊酚Ⅲ组垂体细胞整体数目有所减少，细胞间窦状毛细血管增多，细胞排列不规则增加。见图 2。

2.4 大鼠海马内Akt及Aβ含量变化

Western blot检测发现，连续麻醉10 d后，与对照组比较，丙泊酚Ⅰ组、丙泊酚Ⅱ组和丙泊酚Ⅲ组海马内的Akt 蛋白表达降低（P < 0.01），Aβ表达明显增加（P < 0.01）。见图3。

3 讨论

清醒状态下大鼠大脑中的神经元处于活动状态，信号主要为高频低幅的去同步波，序列的复杂度高，自相似性低，对应δ波值高；麻醉状态大鼠大脑中的神经元处于意识和感觉的抑制状态，信号主要为低频同步波，序列复杂度低，自相似性高，对应的δ波值低；麻醉状态愈深，神经元抑制越严重，对应的脑电δ波值越低。

为了避免丙泊酚在腹腔注射出现部分吸收的缺点，在给药的途径上利用大鼠尾部静脉注射的方式使这一缺点得到大大的改善，能够确保丙泊酚在大鼠体内的血药浓度的稳定性，本研究从麻醉诱导到维持仅仅使用了丙泊酚这一种麻醉药，很好地避免了其他麻醉药物对实验结果的干扰，因此笔者观察到丙泊酚对大鼠下丘脑，垂体以及海马的影响变得更加准确。Larsson等[11]和Jang等[12]研究发现丙泊酚按10 mg/mL麻醉大鼠时，其血流动力学波动最小且麻醉效果最稳定，因此，本研究选用10 mg/mL为起点，检测10、20、30 mg/mL三个浓度下的丙泊酚对大鼠下丘脑，垂体以及海马Aβ的影响。

下丘脑与脑下垂体共同组成了完整的神经内分泌功能系统[13-14]，此系统可以通过下丘脑促垂体区的肽能神经元分泌的肽类神经激素，经垂体门脉系统输送至腺垂体，促使相应的腺垂体激素分泌，此外，还可通过轴浆流动方式把下丘脑的神经内分泌细胞分泌的肽类神经激素经送达神经垂体，并在神经垂体中贮存。垂体分泌的激素除了能够直接分泌促激素作用于相应的靶腺外，还可以调节靶器官的功能活动，并经靶腺激素间接调节某些器官的生理功能[15-17]。麻醉对下丘脑、腺垂体的作用是可能是通过HPOA反馈过程间接发生的，只有当丙泊酚对靶器官的毒性作用增强到极限时，这时才会反馈于下丘脑和腺垂体，导致其病理的发生，而本实验发现，低剂量麻醉时由于麻醉剂量较低或给药时间较短，尚不足以使下丘脑垂体发生病变，当不断地加大麻醉剂量时，下丘脑和腺垂体反馈作用增强，导致病理变化的发生[18]。

Akt是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是多条信号通路的重要交叉点，Akt具有调节细胞生长、分化及凋亡的关键作用，有研究发现，激活Akt途径能够减轻Aβ对细胞的毒性作用[19-21]，本研究发现，连续麻醉10 d后不同剂量丙泊酚都对Aβ的沉积产生了促进作用，这意味着高剂量的丙泊酚对大鼠淀粉样β蛋白的影响作用可能是通过降低Akt途径实现的。

[参考文献]

[1] Hemandez Rabaza V，Llorens-Martin M，Velazquez-Sanchez C，et al. Inhibition of adult hippocampal neurogenesis disrupts contextual learning but spares spatial working memory，long-term conditional rule retention and spatial reversal [J]. Neuroscience，2009，159（1）：59-68.

[2] 盖志辉，李康，佘晓俊，等.长期噪声暴露对大鼠海马CRF系统的影响[J].解放军预防医学杂志，2017，35（2）：102-105.

[3] Wei H，Xiong W，Yang S，et al. Propofol facilitates the development of long-term depression（LTD） and impairs the maintenance of long-term potentiation（LTP） in the CAI region of the hippocampusof anesthetized rats [J]. Neurosci Lett，2002，324（3）：181-184.

[4] Ishizeki J，Nishikawa K，Kubo K，et al. Amnestic concentrations of sevoflurane inhibit synaptie plasticity of hippocampal CAl neurons through gamma aminobutyrie acid-mediated mechanisms [J]. Anesthesiology，2008，108（3）：447-456.

[5] Judge O，Hill S，Antognini JF. Modeling the effects of midazolam on cortical and thalamic neurons [J]. Neurosci Lett，2009，464（2）：135-139.

[6] 宋素英，孟欣，佟继铭，等.大黄总蒽醌对雌性大鼠下丘脑、垂体功能和结构的影响及可逆性[J].中国实验方剂学杂志，2017，12（1）：169-173.

[7] 何厦，徐丹，卢娟，等.孕期尼古丁暴露子代大鼠饲喂高脂饮食对下丘脑-垂体-肾上腺轴敏感性的影响及发生机制[J].中国藥理学与毒理学杂志，2017，31（1）：80-86.

[8] 胡恩元，张敏，肖践明.慢性压力与冠心病患者体内皮质醇水平的关系[J].心血管病学进展，2017，38（1）：94-97.

[9] 高春芳，张根葆，陆晓华，等.清醒与麻醉状态下大鼠脑电复杂度特征的比较[J].临床麻醉学杂志，2017，33（1）：63-65.

[10] 刘军辉，赵永灵，喻军.Livin蛋白表达于结直肠癌组织病理参数间关系研究[J].中华实用诊断与治疗杂，2015， 29（12）：1160-1162.

[11] Larsson JE，Wahlstrom G. Optimum rate of administration of propofol for induction ofanaesthesia in rats [J]. Br J Anaesth，1994，73（5）：692-694.

[12] Jang HS，Choi HS，Lee MG. Effects of propofol administration rates on cardiopulmonary function and anaesthetic depth during anaesthetic induction in rats [J]. Vet Anaesth Analg，2009，36（3）：239-245.

[13] 張嘉妮，李玉星，杨梦琳，等.六味地黄汤及“补泻”药对对肾阴虚模型小鼠下丘脑-垂体-性腺轴功能的影响[J].中国现代应用药学，2017，34（1）：25-29.

[14] 孙秋岩，单忠艳，滕卫平，等.应激对下丘脑-垂体-甲状腺轴影响的研究进展[J].山东医药，2015，55（17）：92-94.

[15] 佟继铭，刘梦杰，万慧杰，等.大黄对幼年雌性大鼠下丘脑垂体结构及激素水平的影响[J].中药药理与临床，2016，32（1）：116-119.

[16] 王姝，邓姗.垂体促性腺激素瘤导致的卵巢过度刺激综合征[J].生殖医学杂志，2017，26（1）：70-73.

[17] 赵岩，孙景权，谢敏豪，等.6周自由转轮运动对高脂饲养雄性大鼠性激素及下丘脑-垂体-睾丸轴的影响[J].中国实验动物学报，2016，24（4）：381-387.

[18] 赵盼盼，佟继铭，马淑月，等.大黄不同萃取物对大鼠体质量及下丘脑、垂体组织结构的影响[J].药物评价研究，2017，40（2）：215-219.

[19] Hers I，Vincent EE，Tavare JM. Akt signalling in health and disease [J]. Cell Signal，2011，23（10）：1515-1527.

[20] Yin G，Li LY，Qu M，et al. Upregulation of AKT attenuates amyloidbeta-induced cell apoptosis [J]. J Alzheimers Dis，2011，25（2）：337-345.

[21] 路书彦，杨丽，戴雪伶，等.姜黄素对Aβ1-42诱导的细胞损伤和线粒体途径细胞凋亡的抑制作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2017，31（2）：138-144.

（收稿日期：2017-04-02 本文编辑：苏 畅）