钱斌　李小军　陈蔚

[摘要] 目的 研究青蒿素对胃癌细胞增殖及侵袭的影响。 方法 培养胃癌SGC-7901细胞株并用含有不同剂量青蒿素的无血清DMEM进行干预，分别作为75、150、300 μmol/L青蒿素组，以不含青蒿素的无血清DMEM作为对照组。干预后48 h时，测定细胞的增殖活力、侵袭数目及增殖基因、侵袭基因的mRNA表达量。 结果 处理后48 h时，75、150、300 μmol/L青蒿素组的细胞增殖活力、侵袭数目以及细胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表达量均显著低于对照组，TIMP1、TIMP2的mRNA表达量均显著高于对照组（P < 0.05），且青蒿素剂量越大，细胞增殖活力、侵袭数目以及细胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9的mRNA表达量越低，TIMP1、TIMP2的mRNA表达量越高（P < 0.05）。 结论 青蒿素能够通过抑制细胞周期蛋白及基质金属蛋白酶的表达来抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。

[关键词] 青蒿素；胃癌；增殖；细胞周期；侵袭

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）07（a）-0039-04

[Abstract] Objective To study the effect of artemisinin on the proliferation and invasion of gastric cancer cells. Methods Human gastric cancer cell line SGC-7901 was cultured and dealt with different doses of artemisinin in serum-free DMEM， respectively as 75， 150， 300 μmol/L artemisinin group， serum-free DMEM without artemisinin as control group. After 48 h of intervention， cell proliferation activity， invasion numbers and mRNA expression of proliferation gene， invasion gene were determined. Results After 48 h of intervention， cell proliferation activity， invasion numbers and Ki-67， CyclinD1， CDK4， CDK6， MMP2， MMP9 mRNA expression of 75， 150， 300 μmol/L artemisinin group were significantly lower than those of control group， TIMP1 and TIMP2 mRNA expression were significantly higher than those of control group （P < 0.05）， and the higher the dose of artemisinin， the lower the cell proliferation activity， invasion numbers and Ki-67， CyclinD1， CDK4， CDK6， MMP2， MMP9 mRNA expression， the higher the TIMP1 and TIMP2 mRNA expression （P < 0.05）. Conclusion Artemisinin can inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cells by inhibiting the expression of cell cycle proteins and matrix metalloproteinases.

[Key words] Artemisinin； Gastric cancer； Proliferation； Cell cycle； Invasion

胃癌是我國最常见的消化系统恶性肿瘤之一，近年来的发病率呈逐步升高趋势。目前，胃癌的早期诊断率较低，多数患者确诊时已经发展至中晚期且错过了手术切除的机会。化疗是中晚期胃癌的主要治疗手段，但在化疗过程中胃癌细胞会产生对化疗药物的耐药性并影响化疗效果、造成化疗失败[1-2]。因此，寻找治疗中晚期胃癌的有效辅助药物是临床研究和基础研究的热点。青蒿素是从中药材青蒿中分离得到的有效成分，临床上主要用于疟疾的治疗。近年来基础研究发现，青蒿素具有广泛的抗癌活性，对膀胱癌[3]、宫颈癌[4]、乳腺癌[5]等多种恶性肿瘤细胞的生长均具有抑制作用。但是，青蒿素对胃癌细胞恶性生物学的影响尚不明确。本研究分析了青蒿素对胃癌细胞增殖及侵袭的抑制作用，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

胃癌细胞株SGC-7901购买于中国科学院上海细胞所，DMEM培养基、胎牛血清及胰蛋白酶均购买于Hyclone公司（批号2016C0482），青蒿素购买于Sigma公司（批号2016C215），MTS细胞活力检测试剂盒购买于Promega公司（批号2016-394），RNA抽提试剂盒（批号E2016-24）、cDNA第一链合成试剂盒（批号F2016-039）、荧光定量PCR试剂盒（批号A2016-77）购买于上海康为世纪公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养方法 SGC-7901细胞株复苏后用含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度，每2天更换1次培养基并观察细胞生长状态，待细胞生长至85%～90%后用0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，消化后的细胞接种在培养板中并用于后续处理。

1.2.2 细胞处理方法 培养板中的细胞密度长至80%～90%后，弃去培养基并用不含血清的DMEM清洗2遍，而后加入含有不同剂量青蒿素的无血清DMEM进行干预，分别作为75、150、300 μmol/L青蒿素组，以不含青蒿素的无血清DMEM作为对照组。处理后48 h进行细胞增殖活力、侵袭数目及基因表达的检测。

1.2.3 细胞增殖活力的检测方法 用于细胞增殖活力检测的细胞消化后接种在96孔细胞板中，不同条件处理48 h后，向培养孔内加入20 μL MTS试剂盒的检测液，而后将培养板放回培养箱、继续孵育3～4 h；待培养基变色后，将培养板放置在多功能酶标仪上，测定450 nm处的吸光度值并以该吸光度值作为细胞的增殖活力值。

1.2.4 细胞侵袭数目的检测方法 用于细胞侵袭数目检测的细胞消化后接种在Transwell小室内，不同条件处理48 h后取出小室，PBS洗2遍后去下小室底部的滤膜，结晶紫染色后在显微镜下观察滤膜，随机选择3个高倍视野并对视野内的细胞数目进行计数，而后计算平均值，并以该平均值作为细胞侵袭数目。

1.2.5 细胞中基因mRNA表达量的检测方法 用于基因mRNA表达量检测的细胞消化后接种在12孔细胞板中，不同条件处理48 h后，弃去培养基并用PBS洗2遍，而后使用RNA抽提试剂盒分离细胞中的总RNA，将RNA反转录为cDNA后进行荧光定量PCR扩增，所扩增的基因包括Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、β-actin，扩增条件如下：95℃预变性3 min后95℃ 20 s、特异性退火温度15 s、72℃ 20 s重复45个循环，根据扩增曲线、以β-actin为内参计算上述基因的mRNA相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件录入并分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间计量资料比较采用方差分析，对方差分析有差异的数据进行LSD-t两两比较，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青蒿素处理后的细胞增殖活力和侵袭数目

处理后48 h时，75、150、300 μmol/L青蒿素组的细胞增殖活力、侵袭数目均显著低于对照组（P < 0.05），150、300 μmol/L青蒿素组的细胞增殖活力、侵袭数目均显著低于75 μmol/L青蒿素组（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素组的细胞增殖活力、侵袭数目均显著低于150 μmol/L青蒿素组（P < 0.05）。见表1。

2.2 青蒿素处理后细胞中增殖基因的表达量

处理后48 h时，75、150、300 μmol/L青蒿素组细胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表达量均显著低于对照组（P < 0.05），150、300 μmol/L青蒿素组细胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表达量均显著低于75 μmol/L青蒿素组（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素组细胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表达量显著低于150 μmol/L青蒿素组（P < 0.05）。见表2。

2.3 青蒿素处理后细胞中侵袭基因的表达量

处理后48 h时，75、150、300 μmol/L青蒿素组细胞中MMP2、MMP9的mRNA表达量均显著低于对照组，TIPM1、TIMP2的mRNA表达量显著高于对照组（P < 0.05）；150、300 μmol/L青蒿素组细胞中MMP2、MMP9的mRNA表达量均显著低于75 μmol/L青蒿素组，TIPM1、TIMP2的mRNA表达量显著高于75 μmol/L青蒿素组（P < 0.05），300 μmol/L青蒿素组细胞中MMP2、MMP9的mRNA表达量显著低于150 μmol/L青蒿素组，TIPM1、TIMP2的mRNA表达量显著高于150 μmol/L青蒿素组（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

中晚期胃癌目前尚缺乏有效的靶向治疗药物，常规化疗容易产生耐药性并影响化疗效果[6-7]。因此，寻找治疗中晚期胃癌的有效辅助药物是临床研究和基础研究的热点。青蒿素是从中药材青蒿中提取得到的具有抗疟疾作用的活性成分。近年来关于青蒿素的藥理学研究发现，青蒿素包括双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等衍生物，其中以双氢青蒿素的作用最为广泛，具有广泛的抗癌特性，能够杀伤癌细胞，诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖[8-10]。相关基础研究证实，青蒿素对膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞的生长均具有抑制作用。目前，关于青蒿素对胃癌细胞增殖、侵袭等恶性生物学行为的影响尚不明确。在本研究中，为了明确青蒿素对胃癌细胞恶性生物学行为的影响，首先对不同剂量青蒿素处理后胃癌细胞的增殖活力和侵袭数目进行了分析，结果显示：不同剂量青蒿素组的细胞增殖活力和侵袭数目均显著低于对照组，且青蒿素剂量越大，细胞增殖活力和侵袭数目越低。这就说明青蒿素对胃癌细胞的增殖和侵袭具有抑制作用且该抑制作用呈剂量依赖性的趋势。

胃癌细胞的增殖是造成胃癌病灶生长、体积增大的重要病理环节，细胞周期进程的加速与细胞的增殖密切相关。CyclinD1是目前研究较为广泛的细胞周期蛋白，主要作用于细胞周期G/S期的转换并发挥正性调控作用[11-12]。CyclinD1与CDK4、CDK6形成复合体后能够引起pRb发生磷酸化并释放E2F，进而促进细胞周G1期进入S期。细胞周期G1期进入S期的加速能够促进细胞增殖[13]。Ki-67是在细胞增殖细胞核中特异性表达的分子，能够识别细胞周期中核抗原上的决定簇，Ki-67的表达量能够反映细胞周期进展的速度以及细胞增殖的活力[14-15]。本研究通过分析不同剂量青蒿素处理对胃癌细胞中上述增殖基因表达的影响，发现不同剂量青蒿素组细胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表达量均显著低于对照组，且青蒿素剂量越大，细胞中Ki-67、CyclinD1、CDK4、CDK6的mRNA表达量越低。这就说明青蒿素对胃癌细胞中增殖基因的表达具有抑制作用且该抑制作用呈剂量依赖性的趋势。

胃癌细胞的侵袭是造成胃癌病灶向临近组织浸润、向远处组织浸润的重要病理环节，细胞外基质及细胞基底膜的降解与细胞的侵袭密切相关。MMPs是目前已知对多种蛋白质具有降解作用的一族锌离子依赖性蛋白水解酶。MMPs家族中的MMP2和MMP9对细胞外基质及细胞基底膜中的胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白等多种成分具有降解作用，是细胞中重要的促侵袭基因[16-17]。胃癌病灶中高表达的MMP2和MMP9能够通过降解细胞外基质及细胞基底膜中的多种成分来促进细胞侵袭[18-19]。在局部组织中，MMP2和MMP9的活性受到TIMP1和TIMP2的抑制，TIMP1和TIMP2也是细胞中重要的侵袭抑制基因[20]。本研究通过分析不同剂量青蒿素处理对胃癌细胞中上述增殖基因表达的影响，发现不同剂量青蒿素组细胞中MMP2、MMP9的mRNA表达量均显著低于对照组，TIMP1、TIMP2的mRNA表达显著高于对照组，且青蒿素剂量越大，细胞中MMP2、MMP9的mRNA表达量越低，TIMP1、TIMP2的mRNA表达量越高。这就说明青蒿素对胃癌细胞中促侵袭基因的表达具有抑制作用，对侵袭抑制基因的表达具有促进作用，且该调节作用呈剂量依赖性。

综上所述，青蒿素能够抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，抑制细胞周期蛋白及基质金属蛋白酶的表达，是青蒿素发挥调节作用的分子机制。

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（收稿日期：2017-02-27 本文編辑：张瑜杰）