1 基因敲除概述

基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种定点修饰基因组的新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，其与体细胞核移植技术的成功结合，已经成为一种有效的定点修饰、改造大动物基因组DNA片段的实验策略。或者说基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰、改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。20世纪80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养试验的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。1987年，Thompson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。

简单的说，基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。比如，有一段“序列”：“1234567890”（原基因），敲除后為“1237890”，一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因，如“ABC”，则新的基因为“123ABC7890”，或者不插入基因直接连接，则为“1237890”。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。在基因敲除技术中涉及到的变异类型有基因重组、基因突变、人工诱变。

2 相关试题评析

2.1 考查基因敲除的基本原理

【例1】 基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，将同源DNA片段导入受体细胞，使同源DNA片段在原有位置替代了靶基因片段，达到基因敲除的目的。由此可推测（ ）

A. 基因敲除实际上是删除某个基因，达到使该基因“沉默”的目的

B. 利用基因敲除技术不能修复细胞中的病变基因

C. 基因敲除可定向改变生物体的某一基因

D. 基因敲除技术可治疗先天性愚型

评析：由题意可知基因敲除实际上是替换了某个基因片段，从而达到使该基因“沉默”的目的，A选项错误。基因敲除既可以是敲除相应的正常基因，也可以敲除相应的突变基因，可定向改变生物体的某一基因，B选项错误，选项C正确。先天性愚型是染色体异常引起的遗传病，多了一条染色体，不能用基因敲除治疗，D选项错误。

参考答案：C。

【例2】 基因敲除是根据DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。通常用设计好的DNA片段替代动物细胞内的基因片段，从而达到基因敲除的目的。运用基因敲除技术构建基因敲除动物模型是研究基因功能中较为普遍的一种方法，其基本原理如图1所示。

请回答下列问题：

（1） 在将目的基因导入受体细胞前，需要构建一个基因表达载体。一个理想的基因表达载体，通常由启动子、终止子、目的基因和 等四部分组成。在此过程中，所需使用的相关工具酶是 。

（2） 如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常为 ，基因导入该细胞时，可以采用 等方法。

（3） 上述途径所获得的动物，其后代并非每一个个体都含目的基因，原因是 。

（4） 假设通过基因敲除构建了一个非球形红细胞性贫血（Ⅱ型）模型动物，该动物因丙酮酸激酶缺陷或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷，使红细胞膜变化引起红细胞自溶现象，但若向该动物注射ATP后，自溶现象可明显降低。由此可表明，基因对生物性状的控制方式之一是： 。

（5） 某实验小组向正常小鼠胚胎细胞内导入某“X基因”后，发现靶基因能正常转录形成mRNA，但细胞内却不再合成相应蛋白质，其原因最可能是

。

评析：通过图示，可分析出基因敲除的基本原理：应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

（1） 基因表达载体由启动子、终止子、目的基因和标记基因四部分组成，在构建基因表达载体过程中，需使用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。

（2） 培育转基因动物时，选择的受体细胞通常为受精卵，通过采用显微注射法将基因表达载体导入受精卵中。

（3） 转基因动物是杂合子，在产生后代时等位基因分离，所以后代并非每一个个体都含有目的基因。

（4） 该动物由于酶异常导致红细胞自溶，说明基因通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物性状。

（5） 靶基因能正常转录形成mRNA，但不能合成蛋白质。很显然是翻译过程不能进行，究其原因是“X基因”转录形成的mRNA与靶基因转录形成的mRNA杂交，来阻断蛋白质的合成。

参考答案：（1） 标记基因 限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶 （2） 受精卵 显微注射法（或病毒感染法） （3） 转基因动物为杂合子，在形成生殖细胞时等位基因发生分离 （4） 基因通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物性状 （5） “X基因”转录形成的mRNA与靶基因控制合成的mRNA杂交，抑制其控制合成酶（蛋白质）的过程（或抑制了目的基因的翻译过程）

2.2 考查CRISPR/Cas9基因定点修饰

【例3】 （2016·江苏高考） 近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割（图2）。下列相关叙述错误的是（ ）

A. Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成

B. 向导RNA中的双链区遵循碱基配对原则

C. 向导RNA可在逆转录酶催化下合成

D. 若α链剪切点附近序列为……TCCACAATC……则相应的识别序列为……UCCACAAUC……

评析：此题是对基因编辑技术的考查，在一个全新的学科前沿新情境下，设置了与核心知识点“蛋白质合成”“核酸碱基配对原则”“中心法则”相关的考点，考查学生运用学科知识解决问题的能力。解答本题的关键在于结合图示理解基因编辑技术的操作过程，图中向导RNA为双链RNA，与DNA相似，含有氢键，两条链间遵循碱基互补配对原则；同时理解DNA和RNA在碱基上的区别，前者含T，后者含U，均能与A互补配对，另外理解逆转录过程也是解答本题的关键，以RNA为模板合成DNA。

提供新情境，以最新的科学进展和实验素材为背景进行命题，学生在收集信息的同时，要能与已掌握的相关知识内容相联系，准确处理信息。如上题C选项中提到逆转录酶，要能迅速想到那是以RNA为模板催化合成DNA的。

参考答案：C。

【例4】 猪的肌肉生长抑制素（MSTN）基因可抑制肌细胞的增殖和分化。CRISPR/Cas9是一种最新出现的基因编辑技术，其主要过程是向导RNA（gRNA，含与目的基因部分序列配对的单链区）与Cas9核酸酶结合，引导Cas9核酸酶对DNA局部解旋并进行定点切割。科研人员利用该技术定向敲除猪胎儿成纤维细胞中MSTN基因，以期获得生长速度快、瘦肉率高的新品种，过程如图3所示，其中BsmB I、Kpn I、EcoR I表示相应限制酶的识别位点。分析回答：

（1） 图中①过程用到的工具酶有 ，图中gRNA基因序列设计的主要依据是 。

（2） 科研人员可利用 （方法）将重组质粒导入猪成纤维细胞，经 过程合成Cas9核酸酶。

（3） 过程③与DNA复制相比，特有的碱基配对方式有 。

（4） 分析发现某基因敲除细胞株中MSTN基因的表达水平为正常细胞的50%，说明 。

（5） 欲利用MSTN基因缺失成纤维细胞培育成MSTN基因缺失猪，请简要说出基本的流程。

。

評析：本题考查基因敲除的相关知识。要理清CRISPR/Cas9技术，首先要根据目的基因上两端的碱基序列设计gRNA基因，接着gRNA基因转录出gRNA，Cas9基因转录和翻译出Cas9核酸酶，Cas9核酸酶与gRNA结合后，通过gRNA识别目的基因两端的碱基序列，Cas9核酸酶具有解旋和剪切目的基因的作用，最后DNA自主修复，从而实现了基因的定点敲除。

（1） 图中①过程用到的工具酶有BsmB I和DNA连接酶，图中gRNA基因序列设计的主要依据是MSTN基因两端核苷酸序列，这样gRNA才能识别MSTN基因两端核苷酸序列。

（2） 科研人员可利用显微注射技术将重组质粒导入猪成纤维细胞，经转录和翻译过程合成Cas9核酸酶。

（3） 过程③为RNA与DNA配对，与DNA复制相比，特有的碱基配对方式有U-A。

（4） 分析发现某基因敲除细胞株中MSTN基因的表达水平为正常细胞的50%，说明细胞中位于一对染色体上的两个MSTN基因中仅有一个被敲除，还有一个MSTN基因正常表达。

（5） 欲利用MSTN基因缺失成纤维细胞培育成MSTN基因缺失猪，可利用MSTN基因缺失成纤维细胞的核移植到去除核的卵母细胞中，早期胚胎培养获得胚胎，再经胚胎移植可培养获得MSTN基因缺失猪。

参考答案：（1） BsmB I和DNA连接酶 MSTN基因两端核苷酸序列 （2） 显微注射技术 转录和翻译 （3） U-A （4） 细胞中位于一对染色体上的两个MSTN基因中仅有一个被敲除 （5） 利用MSTN基因缺失成纤维细胞的核移植到去除核的卵母细胞中，早期胚胎培养获得胚胎，胚胎移植培养获得MSTN基因缺失猪

2.3 考查基因敲除在基因工程中的应用

【例5】 利用“基因敲除”技术，能“敲除”DNA上的特定基因。该技术的主要过程如图4所示。

（1） 胚胎干细胞可从小白鼠的 中分离得到。

（2） neoR基因插入靶基因使用的工具酶是

和 ，前者识别特定脱氧核苷酸序列并在特定位点切开。“靶基因失活”的含义是

。

（3） 失活靶基因与正常靶基因互换涉及的变异类型是 ；处理后的胚胎干细胞，转移到特定培养基中筛选培养。“特定培养基”中需加入 以能起到筛选培养的目的。

（4） 科学家可以通过“基因敲除”来研究基因的功能，培养图示中胚胎干细胞所获得的“基因敲除”小白鼠 （填“能”或“不能”）直接用于研究基因功能，原因是 。

评析：本题考查基因敲除、基因工程的相关知识，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络结构的能力。同时要求考生能够在不同情境下综合利用所学知识和技能处理复杂任务，具有扎实的学科观念和宽阔的学科视野，并体现出自身的实践能力、创新精神等内化的综合学科素养。

（1） 胚胎干细胞可以从早期胚胎或原始性腺中分离得到。

（2） 基因工程用到的工具酶包括限制酶和DNA连接酶；基因是控制生物性状的基本单位，当neoR基因插入靶基因后将导致靶基因的结构被破坏，失去原有的结构和功能，结果靶基因失活而不能表达。

（3） 从图解中可以看出，失活靶基因与正常靶基因是同源互换，故两者互换片段属于基因重组；因为neoR基因是新霉素抗性基因，经处理后的胚胎干细胞获得了neoR基因，所以能在含新霉素的培养基上生存，而未经处理的胚胎干细胞在此培养基上无法生存，故“特定培养基”中需加入新霉素才能起到选择作用。

（4） 培养图示中胚胎干细胞所获得的“基因敲除”小白鼠不能直接用于研究基因功能，因为该小白鼠体内仍有一个正常的靶基因，也可能表达性状。

参考答案：（1） 早期胚胎或原始性腺 （2） 限制性核酸内切酶（或限制酶） DNA连接酶 靶基因中的脱氧核苷酸序列发生改变，不能表达 （3） 基因重组 新霉素 （4） 不能 因为该小白鼠体内仍有一个正常的靶基因，也可能表达性状

参考文献：

[1] 吕飞.浅谈“基因敲除”[J].生物学教学，2010.35（10）：61-62.

[2] 张卓鹏.22016年江苏生物学高考题“五性”考查[J].生物学教学，2017.42（1）：54-56.