刘 颖， 柳云恩， 张玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 丛培芳， 史秀云， 金红旭， 侯明晓

沈阳军区总医院 急诊医学部 全军重症(战)创伤救治中心实验室辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

·爆震伤·

颅脑爆震伤后脑组织SOD-1、NOS1和IRE1α表达变化研究

刘 颖， 柳云恩， 张玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 丛培芳， 史秀云， 金红旭， 侯明晓

沈阳军区总医院 急诊医学部 全军重症(战)创伤救治中心实验室辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

目的 分析颅脑爆震伤(bTBI)后，不同时间点小鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD-1)、一氧化氮合酶(NOS1)和内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(IRE1α)的表达变化，探讨相关因子与时间的关系。方法 健康昆明小鼠63只随机分为模型组和正常对照组。按照伤后时间将模型组分为3 h组、6 h组、12 h组、24 h组、48 h组、7 d组和14 d组。采用Evans blue染色、Western-blot和Real-time PCR方法，观察大脑损伤及测定伤后各组小鼠脑组织中SOD-1、NOS1和IRE1α的含量及mRNA的表达变化。结果 与正常对照组相比，模型组小鼠脑组织Evans blue染色呈明显蓝色。与对照组相比，模型组小鼠脑组织各个时间点氧化应激指标SOD-1、NOS1和IRE1α含量的表达均显著增高，48 h后表达量有所降低，但仍高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SOD-1、NOS1和IRE1α等指标参与脑爆震伤的发生和发展，监测相关指标变化对阐明bTBI致脑损伤的发生机制具有一定的意义。

颅脑爆震伤； 超氧化物歧化酶； 一氧化氮合酶； 内质网跨膜蛋白肌醇酶1α

颅脑爆震伤(blast-related traumatic brain injury，bTBI)作为爆震伤发生时主要损伤[1-3]，其损伤机制复杂，临床治疗十分困难。尽管目前国内外对bTBI进行了一定程度的研究，但有关爆震伤中颅脑损伤的致伤特点及致伤机制并未十分清楚[4-5]。因此，本研究通过建立bTBI小鼠实验动物模型，检测不同时间点小鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD-1)、一氧化氮合酶(NOS1)和内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(IRE1α)的变化，探讨氧化应激在bTBI中的作用，旨在为战时bTBI伤员的救治方法的研究提供理论参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 2%Evans blue购自Sigma公司；鼠抗GAPDH单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗SOD-1多克隆抗体、兔抗NOS1多克隆抗体、兔抗IRE1α多克隆抗体及相应二抗均购自美国CST公司；Western-blot一抗稀释液购自中国碧云天生物技术研究所；SOD-1、NOS1、IRE1α和GAPDH引物由沈阳汇佰生物科技有限公司合成。

1.2 实验动物及分组 选取健康雄性昆明小鼠63只，平均体质量(20±3)g，随机分为模型组和正常对照组。按照伤后时间将模型组分为3 h组、6 h组、12 h组、24 h组、48 h组、7 d组和14 d组。清洁级动物房饲养，适应性喂养1周后开始实验。

1.3 动物模型建立 模型组采用爆震冲击装置建立颅脑损伤小鼠动物模型[6]。小鼠麻醉后放置于爆震伤装置上，通过保护管保护小鼠胸腹部，头部外露。对照组不致伤，仅作为脑组织中SOD-1、NOS1和IRE1α测定的对照。

1.4 Evans blue观察小鼠脑损伤 各组动物处死前0.5 h经尾静脉注入2% Evans blue(2 ml/kg)，以1%戊巴比妥钠30～40 mg/kg麻醉后打开胸腔，切断右心房，于肺循环心内灌注肝素生理盐水(0.9%氯化钠+20 U/ml肝素钠)100 ml冲洗。取脑组织称质量，剪碎置于1 ml二甲基甲酰胺中，匀浆后60℃孵育24 h。12 000 r/min离心20 min。用酶标仪检测波长为630 nm的吸光度，进行数据分析，根据绘制的Evans blue标准曲线计算Evans blue含量。1.5 Western-blot检测脑组织SOD-1、NOS1和IRE1α含量 分别于bTBI后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、7 d和14 d提取蛋白后，将蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜上，于含3%牛血清白蛋白的TBST(含0.05% Tween-20的TBS)中室温封闭1 h，分别用兔抗SOD-1、NOS1和IRE1α多克隆抗体及鼠抗GAPDH单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，分别用相应二抗室温孵育1 h。TBST漂洗3次，用ECL Western印迹试剂盒进行化学发光检测。

1.6 RT-PCR检测SOD-1、NOS1和IRE1αmRNA表达 利用Trizol reagent提取组织总RNA。取4.0 μg总RNA，65℃变性5 min，经AMV逆转录酶42℃逆转录30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA产物,依次加入10×PCR缓冲液、上游与下游引物各50 pmol、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl 22.0 mmol/L、TaqDNApoly-merase 1 U，以下列条件进行扩增：94℃下3 min,50℃下45 s，72℃下45 s。进行30次循环后进一步延伸，72℃下5 min。根据GenBank中SOD-1、NOS1和IRE1α cDNA序列，用引物设计软件Primer5设计特异性引物，见表1。

表1 特异性引物

2 结果

2.1 Evans blue检测结果 与对照组相比，模型组小鼠脑组织Evans blue染色呈蓝色(图1)，Evans blue相对含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示，爆震伤可导致小鼠脑损伤发生。

2.2 Western-blot检测结果 与对照组相比，模型组小鼠脑组织各个时间点氧化应激指标SOD-1、NOS1和IRE1α含量的表达均显著增高，48 h后表达量有所降低，但仍高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 Evans blue检测结果(a.模型组小鼠脑组织Evans blue染色；b.Evans blue相对含量，与对照组比较①P<0.05)

图2 不同时间点脑组织中SOD-1、NOS1和IRE1α表达水平(与对照组比较，①P<0.05)

2.3 Real-time PCR检测结果 各时间点脑组织SOD-1、NOS1和IRE1α的mRNA表达均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，SOD-1表达在3 h时开始升高，12 h时达到最高；NOS1、IRE1α表达在3 h时开始升高，24 h时达到最高。见表2。

3 讨论

bTBI发生后，原发性损伤及继发二次损伤可导致细胞中产生大量的氧自由基，进而造成脂质、蛋白质及核酸过氧化，损伤神经细胞损伤及破坏血脑屏障完整性[7]。本研究发现，bTBI发生后小鼠脑组织Evans blue染色呈明显蓝色，Evans blue相对含量显著升高，说明爆震伤发生对脑组织血脑屏障起到一定程度的破坏作用。

表2 不同时间点脑组织中SOD-1、NOS1和IRE1α的mRNA表达水平

注：与对照组比较，①P<0.05

SOD作为重要的过氧化物酶，在脑自由基清除和抑制脂质过氧化过程中有着关键性的作用[8]。对于正常小鼠脑组织，氧自由基的生成与SOD的清除能力能够形成稳定的动态平衡；bTBI发生后，SOD消耗会明显增多，导致生成与消耗的动态平衡破坏，进而加剧脑组织细胞损伤的发生[9]。

一氧化氮(NO)作为血管神经活性物质，具有参与学习记忆的形成，参与继发性损伤，改变神经元毒性和突触可塑性等多种作用[10]。目前研究认为，NO在产生的最初几小时具有扩张血管和抑制血小板聚集的功能，对脑损伤能够起到一定的保护作用；但过多的NO产生和释放，可通过自由基的产生造成神经毒性，加剧损伤的发生[11]。NOS因能够作用于L-精氨酸产生NO，进而参与中枢神经系统多种生理功能调节，已在脑损伤相关疾病中得到广泛关注[12-13]。在脑缺血疾病发生的早期，NOS-1表达阳性神经元数量会显著增加，此外，在脑出血疾病发生时，NOS-1的表达同样明显增高。NOS活性在脑损伤疾病中上调会产生大量NO，进而加重脑组织损伤[14-15]。

研究表明，内质网应激在脑损伤的发生发展中同样发挥重要作用[16]。IRE1α作为蛋白质合成和加工最大的场所内质网上的感受蛋白，在内质网应激发生后，一方面会通过其丝/苏氨酸蛋白激酶和位点特异的核酸内切酶活性，增加蛋白质的折叠能力，促进内质网的正常功能恢复；另一方面会通过相关通路蛋白导致细胞凋亡损伤的发生[17-18]。

本研究结果提示，bTBI发生后小鼠脑组织各个时间点化应激指标SOD-1、NOS1和IRE1α含量的表达均显著增高。bTBI后机体瞬间产生严重应激反应，SOD-1、NOS1和IRE1α等氧化应激相关因子参与bTBI的发生发展，且表达量与损伤时间具有相关性。

综上所述，SOD-1、NOS1和IRE1α在bTBI的损伤机制探讨中具有重要意义，检测SOD-1、NOS1和IRE1α的表达变化能够为爆震导致脑损伤的有效救治提供指导。

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The changes of expressionof SOD-1,NOS1 and IRE1α in blast-related traumatic brain injury

LIU Ying,LIU Yun-en,ZHANG Yu-biao,TONG Chang-ci,SHI Lin,CONG Pei-fang,SHI Xiu-yun,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the changes of expression of SOD-1,NOS1 and IRE1α in mouse brain at different time points of blast-related traumatic brain injury(bTBI),and investigate the relationship between correlation factors and time.Methods A total of 63 healthy male rats were randomlydivided into the model group and the normal control group.According to the injury time,the rats in the model group were divided into the groups of 3 hours,6 hours,12 hours,24 hours,48 hours,7 days and 14 days.Evans blue,Western-blot and Real-time PCR methods were used for determination injury and expression changes of SOD-1,NOS1 and IRE1α inbrain tissue.Results Compared with normal control group,the Evans blue staining of brain tissue in model group was in significantly blue.The expression of SOD-1,NOS1 and IRE1α at different time points in brain tissue of model group were significantly increased and reduced after 48 hours,while still higher compared to the normal control group(P<0.05).Conclusion SOD-1,NOS1 and IRE1α involves in the occurrence and development of brain blast injury,which has certain significance to monitor the changes of related indicators clarifying the mechanism of bTBI induced brain injury.

Blast-related traumatic brain injury; SOD-1; NOS1; IRE1α

全军十二五面上项目(CSY12J002)；全军重大新药创制项目(2013ZX09J13109-02B)；全军十二五面上项目(CSY13J002)； 总后卫生部重大新上(ASM14L008)；辽宁省自然科学基金(201602771)

刘 颖(1990-)，女，辽宁铁岭人，技师，硕士

侯明晓，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0210-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.04

2017-05-12