史秀云， 柳云恩， 张玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 丛培芳， 刘 颖， 金红旭， 侯明晓

沈阳军区总医院 急诊医学部 全军重症(战)创伤救治中心实验室辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

·爆震伤·

小鼠脑爆震伤中PI3K/Akt通路及相关凋亡蛋白表达情况

史秀云， 柳云恩， 张玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 丛培芳， 刘 颖， 金红旭， 侯明晓

沈阳军区总医院 急诊医学部 全军重症(战)创伤救治中心实验室辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

目的 探讨小鼠脑爆震伤后不同时间点磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路及相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达情况。方法 将50只雄性小鼠通过随机数字表法分为对照组(n=10)和模型组(n=40)，再将模型组根据造模成功后时间分为3 h组、6 h组、12 h组和24 h组，每组各10只。测定各组脑组织含水量与伊文思蓝含量，并采用Western blot以及实时荧光定量PCR等技术检测各组小鼠脑组织中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax的含量和mRNA的表达变化。结果 模型组各时间点脑组织含水量与伊文思蓝含量较对照组均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测与实时荧光定量PCR检测结果一致。Akt、PI3K和Bcl-2表达，3 h组、6 h组均较对照组显著降低，6 h组达到最低，差异均有统计学意义(P<0.05)；12 h组、24 h组较6 h组有所升高，但仍低于对照组，且与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Bax表达，3 h组、6 h组、12 h组均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；24 h组较12 h组有所降低，但仍高于对照组，且与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 颅脑爆震伤中PI3K/Akt通路和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达变化对其判断和治疗有一定提示作用。

颅脑爆震伤； 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路； Bcl-2； Bax

近年来，暴恐袭击事件增多以及高能武器大量应用使得爆震伤发生率逐年递增[1]。爆震伤伤情复杂，死亡率高，其中以头部损伤造成的后果最为严重[2-3]。由于脑部结构复杂，生物机制多变，目前关于脑爆震伤的伤情特点及致伤机制的研究还处于起步阶段。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路是重要的细胞存活信号通路，已被证实在脑缺血神经细胞凋亡中起调控作用[4]。而Bcl-2和Bax是研究较为深入的与凋亡调控相关的蛋白[5-6]。因此，本研究通过建立脑爆震伤的小鼠模型，检测不同时间点脑组织含水量与伊文思蓝含量，以及脑组织中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax的表达情况，探讨PI3K/Akt通路及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax在脑爆震伤中的作用，旨在为研究爆震伤致脑损伤的损伤特点及机制提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选取50只雄性昆明小鼠，由沈阳军区总医院动物实验中心提供并饲养，食物、水由动物实验中心提供，确保不含对本研究结果引起干扰的成分。将50只雄性小鼠通过随机数字表法分为对照组(n=10)和模型组(n=40)，再将模型组根据造模成功后时间分为3 h组、6 h组、12 h组和24 h组，每组各10只。

1.2 小鼠脑爆震伤模型构建 将小鼠麻醉后，放于保护罩内，保护小鼠其他部位，只显露脑部，随后将其固定于自主设计研发的高仿真爆震伤模型装置的网状部位，下方空气压缩装置使空气压缩，将0.8 mm的铝薄放于中间层固定，通电后铝膜爆破，下方炮筒压力达0.12 MPa，超压波显示压力为0.55 MPa。

1.3 脑组织含水量与伊文思蓝含量检测 脑组织含水量采用干湿法中的Bliott公式计算，取全脑组织用电子天平称质量(湿质量，精确到0.1 mg)，置于恒温箱烘烤24 h后称干质量。伊文思蓝含量检测需在各组动物处死0.5 h前以2 ml/kg的比例尾静脉注入2% EB。麻醉后打开胸腔，心内灌注肝素生理盐水200～300 ml，断头取脑称取质量后剪碎放于二甲基甲酰胺，经37℃水浴24 h后,1 000 r/min离心5 min，取上清液测定光密度(OD)并记录，计算后得到伊文思蓝含量。

脑组织水含量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%

1.4 Western blot检测 分别于脑爆震伤后3、6、12、24 h取小鼠脑组织并将取得的脑组织即刻置于液氮罐中冻存待用。将冻存在液氮中的脑组织取出，置于冰上融化，加入RIPA裂解液后制备成组织匀浆，离心后取上层蛋白溶液，测定其蛋白的浓度并配平，置于-80℃中备用。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，经过电泳、转膜之后，加入一抗GADPH(购自Santa公司)、PI3K(购自Abcam公司)、Akt(购自Abcam公司)、Bcl-2(购自Abcam公司)及Bax(购自Abcam公司)，经4℃杂交过夜，二抗孵育，ECL发光，最后通过凝胶成像系统采集图像。

1.5 实时荧光定量PCR检测 取适量脑组织置于研钵中，加入液氮后将组织研碎，按Trizol试剂操作说明书进行。RNA沉淀干燥后，加入DEPC水复溶。依照逆转录试剂盒说明书操作，得到表达的cDNA。通过SYBR Green实时荧光定量PCR法，对GADPH、PI3K、Akt、Bcl-2和STAT3进行实时荧光定量分析。并以GAPDH为参比基因，计算各目的基因/参比基因的相对定量。

2 结果

2.1 脑组织含水量与伊文思蓝含量检测 模型组各时间点脑组织含水量与伊文思蓝含量较对照组均明显升高，在12 h达到高峰随后降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 Western blot检测 通过Western blot实验检测小鼠脑组织中相关蛋白表达，结果见图1。对AKT、PI3K、Bcl-2和Bax的条带进行半定量分析，结果见图2。结果显示，Akt、PI3K和Bcl-2表达，3 h组、6 h组均较对照组显著降低，6 h组达到最低，差异均有统计学意义(P<0.05)；12 h组、24 h组较6 h组有所升高，但仍低于对照组，且与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Bax表达，3 h组、6 h组、12 h组均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；24 h组较12 h组有所降低，但仍高于对照组，且与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组小鼠脑组织含水量及伊文思蓝含量比较

注：与对照组比较，①P<0.05

2.3 实时荧光定量PCR检测 通过实时荧光定量PCR检测小鼠脑组织mRNA表达，结果见表2。结果显示，AKT、PI3K、Bcl-2和Bax的表达水平与Western blot结果相一致。Akt、PI3K和Bcl-2表达，3 h组、6 h组均较对照组显著降低，6 h组达到最低，差异均有统计学意义(P<0.05)；12 h组、24 h组较6 h组有所升高，但仍低于对照组，且与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Bax表达，3 h组、6 h组、12 h组均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；24 h组较12 h组有所降低，但仍高于对照组，且与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图3。

图1 Western blot结果

图2 Western blot半定量分析结果(与对照组比较，①P<0.05)

组别AKTPI3KBcl-2Bax对照组7.92±1.121.89±0.283.28±0.352.77±0.323h组4.35±1.32①0.92±0.19①1.93±0.21①5.67±1.31①6h组3.56±0.88①0.82±0.17①1.52±0.23①5.77±0.99①12h组5.67±1.011.52±0.342.91±0.255.75±0.84①24h组5.78±1.111.63±0.272.43±0.373.51±0.47

注：与对照组比较，①P<0.05

3 讨论

爆震伤导致的颅脑损伤是爆震伤死亡率居高不下的原因之一，其特点是外轻内重、伤情变化快且伤情复杂[7]。爆震伤对脑组织造成的损伤是由炎症反应、氧化应激等多方面作用的结果，神经凋亡在其中处于关键的环节[8-9]。PI3K/Akt信号传导通路作为细胞生存重要通路之一，通过影响下游通路相关基因转录或其转录调控子的生成,常参与调节机体凋亡和创伤反应的发生发展[10]。其相关凋亡蛋白参与脑损伤的修复和发生的研究已经得到较为广泛的重视。其中，PI3K激活的Akt可以通过磷酸化作用，进一步激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase9、NF-κB等因子促进细胞存活，是重要的抗凋亡调节因子[11]。PI3K/Akt信号分子的下调提示颅脑爆震伤初期神经凋亡的发生[12]。有研究通过小鼠液压伤模型发现，Akt在造模后1h表达减少,4 h回升,24 h达到正常水平[13]，与爆震伤颅脑外伤变化趋势趋于一致。同时，细胞凋亡过程中抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，且呈时间依赖性，并伴有促凋亡蛋白Bax的表达升高，导致抗凋亡和促凋亡因素的比例下降，使细胞走向凋亡。

图3 实时荧光定量PCR结果(与对照组比较，①P<0.05)

脑组织含水量变化可提示脑水肿的发生，爆震伤小鼠的血脑屏障通透性改变与脑组织含水量显著降低是颅脑爆震伤的病理性过程，对于后续相关分子改变和疾病的发展有重要影响[14-15]。因此，本研究通过测定爆震伤后脑组织水含量和伊文思蓝含量，并在不同时间点测量脑组织中PI3K、Akt、Bcl-2和Bax的变化，进一步明确PI3K/Akt通路和相关凋亡蛋白在脑爆震伤中的作用。结果表明，相关蛋白表达的变化趋势和mRNA的变化趋势一致，进一步证明颅脑爆震伤发生时相关凋亡因子的变化情况。

综上所述，颅脑爆震伤后机体产生复杂的应激反应。其中，PI3K/Akt 信号通路和相关的凋亡蛋白参与颅脑爆震伤的发生和发展，其表达量与损伤时间相关。因此，干预其通路的表达可能成为爆震导致脑损伤的有效治疗方法之一。

[1] Chang R,Holcomb JB.Optimalfluid therapy for traumatic hemorrhagic shock[J].Crit Care Clin,2017,33(1):15-36.

[2] Shein SL,Shellington DK,Exo JL,et al.Hemorrhagic shock shifts the serum cytokine profile from pro- to anti-inflammatory after experimental traumatic brain injury in mice[J].J Neurotrauma,2014,31(16):1386-1395.

[3] Mcmahon CG,Kenny R,Bennett K,et al.The effect of acute traumatic brain injury on the performance of shock index[J].J Trauma,2010,69(5):1169-1175.

[4] Tejeda GS,Ayuso-Dolado S,Arbeteta R,et al.Brainischaemia induces shedding of a BDNF-scavenger ectodomain from TrkB receptors by excitotoxicity activation of metalloproteinases and γ-secretases[J].J Pathol,2016,238(5):627-640.

[6] Wennersten A,Holmin S,Mathiesen T.Characterization of Bax and Bcl-2 in apoptosis after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Acta Neuropathol,2003,105(3):281-288.

[7] 柳云恩,刘 颖,史秀云,等.爆震冲击波对大鼠脑组织炎症因子IL-1β、IL-6及IL-10表达影响[J].创伤与急危重病医学,2016,4(6):336-340.

[8] Koliatsos VE,Cernak I,Xu L,et al.A mouse model of blast injury to brain:initialpathological,neuropathological,and behavioral characterization[J].J Neuropathol Exp Neurol,2011,70(5):399-416.

[9] Sponheim SR,Mc Guire KA,Kang SS,et al.Evidence of disrupted functional connectivity in the brain after combat-related blast injury[J].Neuroimage,2011,54(Suppl 1):S21-S29.

[10] Chen SF,Tsai HJ,Hung TH,et al.Salidroside improves behavioral and histological outcomes and reduces apoptosis via PI3K/Akt signaling after experimental traumatic brain injury[J].PLoS One,2012,7(9):e45763.

[11] Chang F,Lee JT,Navolanic PM,et al.Involvement of PI3K/Akt pathway in cell cycle progression,apoptosis,and neoplastic transformation:a target for cancer chemotherapy[J].Leukemia,2003,17(3):590-603.

[12] Zhuang Z,Zhao X,Wu Y,et al.The anti-apoptotic effect of PI3K-Akt signaling pathway after subarachnoid hemorrhage in rats[J].Ann Clin Lab Sci,2011,41(4):364-372.

[13] Noshita N,Lewén A,Sugawara T,et al.Akt phosphorylation and neuronal survival after traumatic brain injury in mice[J].Neurobiol Dis,2002,9(3):294-304.

[14] 戴 晶,刘学磊,金红旭.轻度颅脑爆震伤与血脑屏障关系的研究进展[J].中华急诊医学杂志,2017,26(5):493-497.

[15] 张广林,王本瀚,高国栋,等.原发性颅脑爆震伤犬早期病理生理机制的实验研究[J].中华神经医学杂志,2014,13(10):999-1002.

Expression of PI3K/Akt pathway and related apoptotic proteinsinmouse braininduced by traumatic shock

SHI Xiu-yun,LIU Yun-en,ZHANG Yu-biao,TONG Chang-ci,SHI Lin,CONG Pei-fang,LIU Ying,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the expression of PI3K/Akt pathway and related apoptosis proteins Bcl-2 and Bax at different time points after blast injury.Methods A total of 50 experimental male rats were randomly divided into the control group(n=10)and the model group(n=40).The rats in the model group were divided into the group of 3 hours,6 hours and 24 hours,with 10 rats in each group.Brain water content and Evans blue content were detected in brain tissues.Western-blot and Real-time PCR methods were used for determination of PI3K,Akt,Bcl-2 and Bax content and expression changes of mRNA in mouse brain tissues.Results The brain water content and Evans blue content in model groups at each time point were significantly improved after modeling,and the differences between the groups had statistical significance(P<0.05).Compared with the control group,the expression of PI3K,Akt and anti-apoptotic factor Bcl-2 were significantly lower than those of the control group,and the expression in groups of 12 hours and 24 hours increased back to normal(P<0.05);the expression of pro-apoptotic factor Bax was significantly increased(P<0.05).Conclusion The changes of PI3K/Akt pathway and Bcl-2 and Baxmayhelpdetermine and carry out treatment of craniocerebralblast injury.

Traumatic brain blast injury; PI3K/Akt pathway; Bcl-2; Bax

全军十二五面上项目(CSY12J002)；全军重大新药创制项目(2013ZX09J13109-02B)；全军十二五面上项目(CSY13J002)； 总后卫生部重大新上(ASM14L008)

史秀云(1991-)，女，辽宁铁岭人，技师，硕士

侯明晓，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0215-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.05

2017-5-22