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天香丹干预冠心病秽浊痰阻证病人血浆miR-126表达水平变化研究

郭龙龙，安冬青，刘伟，孙龙飞

目的研究血浆miR-126在冠心病秽浊痰阻证病人的变化及天香丹的干预作用。方法收集冠心病病人40例及非冠心病病人20例，采集入院后24 h内的清晨空腹静脉血标本，冠心病病人口服天香丹28 d后清晨采集空腹静脉血标本，以miR-39为参照基因，miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒提取血浆总microRNA，反转录成cDNA，并用SYBR Green I实时荧光定量PCR反应检测血浆中microRNA-126的相对表达量，分析microRNA相对表达量各组中的变化及其临床应用价值。结果非冠心病组血清中miR-126相对表达量0.86(0.81～0.90)；冠心病秽浊痰阻证基础治疗组血清中miR-126相对表达量1.10(0.99～1.20)；冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹组血清中miR-126相对表达量0.71(0.61～0.81)。与非冠心病组比较，冠心病秽浊痰阻证基础治疗组miR-126表达量显著上调，差异有统计学意义(Z=-4.166，P=0.001)；冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹组miR-126表达量差异无统计学意义(Z=-1.880，P=0.06)；与基础治疗组比较，冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹组miR-126表达量明显下调，差异有统计学意义(Z=-4.139，P=0.001)。依据miR-126在冠心病秽浊痰阻证病人与非冠心病血清中表达量的不同，利用受试者工作特征受试工作特征(ROC)曲线分析，曲线下面积(AUC)=0.886(95%CI：0.796～0.976，P=0.001)，敏感性为72.5%，特异性为95.0%。结论在冠心病秽浊痰阻证病人血清中miR-126呈现高表达，根据ROC分析结果达到临床应用价值，是冠心病秽浊痰阻可选的诊断分子标志物，MiR-126在天香丹干预后表达量下降，说明miR-126有可能在冠心病发病过程中具有保护作用。天香丹可能通过干扰microRNA，继而影响靶mRNA的降解和翻译，治疗冠心病。

冠心病；秽浊痰阻证；天香丹；miR-126；胸痹

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病，CAD)是世界上发病率和病死率最高的疾病之一，尤其是近年来冠心病呈现年轻化的趋势[1]，因此，应更加深入地了解其发生、发展以及预后，从而为其早期诊断及治疗提供有效的解决办法。冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型，故冠心病的发生与动脉粥样硬化(AS)的形成过程密切相关。冠心病形成机制有多种，现公认的是在各种危险因素(高血压、高血脂、高血糖、肥胖、吸烟、感染等)的影响下，血管内皮细胞和平滑肌细胞产生过度的慢性炎性增生，导致动脉粥样硬化，发生心血管事件[2]。microRNA(miRNA)是一组生物进化过程中高度保守的小RNA，不参与编码，但在基因转录及转录后起到调控细胞增殖、分化、凋亡等作用[3-4]。通过降解 mRNA 或抑制蛋白质翻译而调控基因的表达。大量研究表明：miRNA与心血管疾病的发生、发展密切相关[5-6]。miRNA可通过调节内皮细胞结构及功能，抑制炎症反应及内皮细胞增殖、迁移、凋亡等参与动脉粥样硬化，预防冠心病[7]。

miRNA作为疾病诊断及治疗的研究已经成为近期研究的热点，近年来大量相关研究发现miR-1-2、miR-208、miR-499、miR-126等都有可能成为心肌梗死的生物学标志物，有研究表明miR-126为血管内皮细胞表达最丰富的microRNA[8]。本研究观察冠心病秽浊痰阻证病人血浆miR-126的表达水平变化以及天香丹的干预作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取新疆医科大学第四附属医院收治的40例病人，按病人症状、体征心电图、心肌酶谱、心脏超声、冠状动脉造影结果以及中医四诊合参，冠心病秽浊痰阻证基础治疗病人20例，年龄(57±11)岁；冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹治疗病人20例，年龄(55±12)岁。使用促凝管收集40例病人血液标本，分别定为冠心病秽浊痰阻证基础治疗组和冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹组。另选取我院同期非冠心病病人20例血液样本作为对照组，男9例，女11例，年龄(52±10)岁。3组年龄比较无统计学意义(P=0.079)。所有血液样本均在收集后3 h内处理，处理方法：于低温离心机中以 4 ℃，1 200 r/min 离心 10 min。为进一步去除细胞碎片，离心后将上层血清移至一个新的 EP 管，再次进行离心，4 ℃条件下以12 000 r/min离心 5 min。将再次离心后的上清液进行分装后(500 μL/管)保存于-80 ℃冰箱。保存待用。

1.2 主要试剂与仪器 miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒、反转录试剂盒miScript II RT Kit和miScript SYBR®Green PCR Kit试剂盒均购置于德国QIAGEN公司，特异性反转录引物均由北京天根生化科技有限公司合成。分光光度计Nanodrop ND-1000购于美国ABI公司，无水乙醇、羟基乙醇等其他常规试剂和常规仪器均由新疆医科大学第一附属医院实验室提供。

1.3 血清总RNA提取 按miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒说明书操作提取血清中总RNA。通过分光光度计测定提取的RNA纯度和浓度，以RNA在260 nm处吸光值与在280 nm处吸光值的比值(A260/A280)来表示RNA纯度，A260/A280=1.9～2.1则认为提取的RNA纯度较满意。

1.4 反转录 miR-126及miR-39引物序列。使用反转录试剂盒MiScript II RT Kit合成cDNA，根据说明书要求分别加入总RNA、10x Nucleics Mix和5x miScript HiSpec Buffer和RNA酶抑制剂等，混合成总体积20 μL反应液进行实时荧光定量PCR反应。反应条件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，1个循环，最后维持4 ℃。新合成的cDNA放置于-20 ℃保存待用。

1.5 实时荧光定量PCR 使用miScript SYBR®Green PCR Kit试剂盒进行定量，按试剂盒说明书分别加入融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix、10x miScript Precursor Assay、template cDNA，和 RNase-free water以及上游引物、下游引物，最后混合成总体积为20 μL反应液 。定量PCR反应条件：变性95 ℃3 min；退火58 ℃10 s，延伸65 ℃ 30 s，进行40个循环。每个样本每种miRNA均重复2次，最后取平均值，并同时使用阴性对照(反应液20 μL中，除2 μL的cDNA用2 μL的无RNA酶水代替外，其他成分均相同并同时进行定量PCR扩增)。用SDS 1.4软件计算每个样本的CT值。相对基因表达分析采用等式2-△△CT法，条件是目标基因和内参基因的扩增效率均接近100%，且相互间的效率偏差<5%。

△△CT=△CT实验组-△CT对照组

△CT实验组 =CT目标基因实验组-CT内参基因实验组

△△CT对照组 =CT目标基因对照组 -CT内参基因对照组

2-△△CT表示实验组相对于对照组目的基因的表达倍数。选用miR-39作为内参基因，对目的基因进行归一化处理。

2 结 果

2.1 血清miR-126与内参基因miR-39的CT值 非冠心病组、冠心病秽浊痰阻证基础治疗组和冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹组miR-126的CT值分别为31.860±0.302，32.879±0.228，32.779±0.495，差异有统计学意义(F=48.78，P<0.001)；内参基因miR-39的CT值分别为22.957±0.371，23.378±0.876，23.398±0.972，差异无统计学意义(F=0.468，P=0.628)。miR-39将作为本研究的内参基因来对目标基因标化处理。

2.2 血清miR-126相对表达量 非冠心病组血清中miR-126相对表达量0.86(0.81～0.90)；冠心病秽浊痰阻证基础治疗组血清中miR-126相对表达量1.10(0.99～1.20)；冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹组血清中miR-126相对表达量0.71(0.61～0.81)；与非冠心病组比较，冠心病秽浊痰阻证基础治疗组表达量显著上调，差异有统计学意义(Z=-4.166，P=0.001)；冠心病秽浊痰阻证基础治疗+天香丹组表达量差异组无统计学意义(Z=-1.880，P=0.06)；与基础治疗比较，基础治疗+天香丹组表达量明显下调，差异有统计学意义(Z=-4.139，P=0.001)。

2.3 绘制受试者工作特征曲线 依据MiR-126在冠心病秽浊痰阻证病人与非冠心病血清中表达量的不同，利用受试者工作特征受试工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析，曲线下面积(area under the curve，AUC)=0.886(95%CI：0.796～0.976，P=0.001)，敏感性为72.5%，特异性为95.0%。

3 讨 论

血脂代谢相关microRNA的发现为心血管和代谢性疾病研究提供新的视野。最新的研究表明miRNA在冠心病的发生进展中起着重要的调控作用[9]，microRNA与冠心病形成的重要基础炎症、脂代谢、动脉粥样硬化等密切相关[10]。Harris等[11]发现，miR-126 可以抑制血管黏附细胞因子1(VCAM-1)的表达和减少白细胞与内皮细胞的相互作用从而参与到血管炎症反应之中；MicroRNA-125a-5p参与巨噬细胞对致动脉粥样硬化脂质的炎症应答[12]；microRNAs17-5p-20a-106a[13]是通过调控AML-1以及M-CSF受体而调控单核细胞的生成，它与AML-1的mRNA3′UTR结合后，mRNA降解，阻碍了AML-1的翻译，表明microRNA可通过其靶标以及靶标介导的通路参与调节单核细胞系的发育、分化，进而调控单核细胞参与炎症反应。miR370和miR122分别下调转录因子固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1c)和酶甘油二酯酰基转移酶2(DGAT2)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(Acc1)[14]减少血浆胆固醇水平，增加肝脏脂肪酸的氧化，减少肝脏脂肪酸和胆固醇合成率[15]。miRNA可通过调节脂质代谢、细胞间黏附分子和各种炎症因子的表达[16]、细胞周期进程和细胞增殖、内皮细胞的功能、血管生成、斑块形成和破裂氧化应激、血小板活化，而直接或间接参与AS的病理生理过程[10，17-18]，通过microRNA的各种靶标调控各种参与AS的细胞和各种炎性细胞分子等进而影响AS的进程。在机体发生冠心病后，往往会伴有miRNA表达异常，其调节“保护”基因或“破坏”基因的作用，且循环miRNA在血清/血浆中稳定性较好，循环miRNA反映冠心病中的miRNA表达水平。作为生物检测样本，血清具有取材方便、相对无创，并可连续体外检测的优点，使得miRNA作为冠心病生物学标志表现出极大应用前景[19-20]。对microRNA与冠心病关系的研究将促进其诊断水平的提高，对寻找其特异性诊断指标和促进新药开发的进展有一定帮助。前期研究表明miRNA-126对冠心病的发生发展有保护性作用，本研究在其基础上使用天香丹治疗，为中医药治疗冠心病的治疗靶点及作用提供分子生物学标志物。

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B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.22.015

1672-1349(2017)22-2850-03

新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题(No.2015KL016)

新疆医科大学中医学院(乌鲁木齐 830000)

安冬青，E-mail：326468701@qq.com

信息：郭龙龙，安冬青，刘伟，等.天香丹干预冠心病秽浊痰阻证病人血浆miR-126表达水平变化研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(22)：2850-2852.

2017-03-21)

(本文编辑 郭怀印)